细胞迁移与细胞侵袭实验

细胞迁移 (cell migration) 也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的定向移动，它是机体细胞的一种正常功能行为。而细胞侵袭（cell invasion）是指细胞通过细胞外基质从一个区域迁移到另一个区域的能力，常用来评估肿瘤细胞在正常组织中转移的能力，但正常细胞，如巨噬细胞也有相同的能力。分析细胞迁移或侵袭能力的常见方法有Transwell迁移、Transwell侵袭和细胞划痕。

 

一、细胞划痕实验

1．实验原理

细胞划痕是较为简捷测定细胞迁移运动的方法，类似机体伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它实验器材在细胞生长的中央区域划线，轻柔去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，观察划痕周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力。

 

2．实验步骤

2.1 细胞铺板

2.1.1 弃去原先的培养基，加入胰酶消化，1300 r/min，离心3 min；

2.1.2 弃上清，加入1 mL新鲜培养基重悬，制成单细胞悬液，并用血球计数板进行计数；

2.1.3 加入培养基，将其稀释为5×10⁵个/mL（不同细胞具体数量不同，根据生长快慢进行调整）；

2.1.4 将稀释后的细胞悬浮液加入到24孔板中，每个孔板1 mL，十字交叉法混匀后，放置37 ℃，5% CO₂培养箱内培养。

2.2 划痕

2.2.1 在显微镜下观察，当细胞铺满整个孔板时，用白枪头在板子的中央画一条垂直的竖线；

2.2.2 弃去培养基，加入1 mL PBS洗去漂浮的细胞；

2.2.3 弃去培养基后，加入1 mL 不含血清的基础培养基，放置于培养箱培养。

2.3 拍照

待细胞培养至预定时间点后，进行光学显微成像，保存原始图片。

3. 实验结果示例

划痕后继续培养24 h，实验组的细胞的往中间迁移的速度比对照组的快，细胞迁移能力强。

 

二、Transwell迁移或侵袭实验

1. 实验原理

Transwell顾名思义是“穿孔实验”，其基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。将细胞种在上室内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。Transwell迁移与侵袭实验的差别在于后者需要在上室底部铺上基质胶。

 

2. 实验步骤

2.1 Transwell迁移

2.1.1 吸出培养皿中原有的培养基，加2 mL PBS清洗；

2.1.2 弃PBS，加2 mL 胰酶消化3 min，吹打转移至EP管中，1000 rpm，离心5 min；

2.1.3 弃上清，加1mL无血清培养基混匀成细胞悬液，细胞计数。

2.1.4 往小室加200 μL细胞悬液，24孔板中加入500 μL的含血清培养基；

2.1.5 培养箱中培养24 h；

2.1.6 取小室弃培养基，用PBS清洗两遍；

2.1.7 棉签擦掉小室里层的细胞，用组织固定液固定10 min；

2.1.8 风干，用结晶紫染料浸泡10 min；

2.1.9 用PBS清洗掉多余染料，风干后计数拍照（100×）。

2.2 Transwell侵袭

2.2.1 基质胶在4 ℃过夜融化；

2.2.2 用4 ℃预冷的无血清培养基稀释基质胶至终浓度1 mg/mL（冰上操作）；

2.2.3 在小室底部中央垂直加入100 μL稀释后的基质胶，37 ℃孵育4小时，成干胶状；

2.2.4 吸出培养皿中原有的培养基，加2 mL PBS清洗；

2.2.5 弃PBS，加2 mL 胰酶消化3 min，吹打转移至EP管中，1000 rpm，离心5 min；

2.2.6 弃上清，加1 mL无血清培养基混匀成细胞悬液，细胞计数；

2.2.7 往小室加200 μL细胞悬液，约5×10⁴个细胞（空培养基稀释），下室中加入500 μL含10%血清的培养基；

2.2.8 放置37 ℃培养箱中培养24 h；

2.2.9 取小室，弃培养基，用PBS清洗两遍；

2.2.10 棉签擦掉小室里层的细胞，用4%组织固定液固定10 min；

2.2.11 风干，用0.1% 结晶紫染料浸泡10 min；

2.2.12 用PBS清洗掉多余染料，风干后拍照计数（100×）。

 

3. 结果示例

穿过膜的细胞被结晶紫染成紫色，细胞数量越多，细胞的迁移/侵袭能力越强。

 

参考文献

[1] Vang Mouritzen M, Jenssen H. Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera. J Vis Exp. 2018 Aug 8;(138):57691.

[2] Martinotti S, Ranzato E. Scratch Wound Healing Assay. Methods Mol Biol. 2020;2109:225-229.

[3] Cory G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 2011;769:25-30.

[4] Marshall J. Transwell(®) invasion assays. Methods Mol Biol. 2011;769:97-110.

[5] Xu J, Liu D, Niu H, Zhu G, Xu Y, Ye D, Li J, Zhang Q. Resveratrol reverses Doxorubicin resistance by inhibiting epithelial-mesenchymal transition (EMT) through modulating PTEN/Akt signaling pathway in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2017 Jan 26;36(1):19.

[6] Flores-Pérez A, Rincón DG, Ruiz-García E, Echavarria R, Marchat LA, álvarez-Sánchez E, López-Camarillo C. Angiogenesis Analysis by In Vitro Coculture Assays in Transwell Chambers in Ovarian Cancer. Methods Mol Biol. 2018;1699:179-186.

 

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