产品介绍：

细胞培养是生命科学研究中常用的实验手段。不同于其它常用的实验方法，细胞培养是一个动态的连续过程，

细胞通常会对操作失误或污染物有所反应，这些反应往往表现出不正常的细胞状态或培养基外观。

如果受到支原体污染时，细胞形态较之无明显变化，污染前期极易被忽视，直到污染非常严重时才能发现。

受污染的细胞膜上可能有几百个支原体，这些支原体竞争营养并释放有毒的代谢产物，

严重影响实验结果。污染来源包括工作环境、操作者本身（一些支原体是人体的正常菌群）、

培养基、血清、细胞交叉污染、实验器材和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。

确认细胞培养过程中出现问题的潜在原因是一项困难且耗时的任务，在细胞培养中，任何突然的变化都应该被怀疑

，同时良好的试验规范和定期检测支原体污染也十分必要。支原体检测的方法有很多种，如直接培养、DNA 荧光染色、ELISA和PCR 法等。

东岭生物（苏州）支原体检测试剂盒主要采用PCR方法对各种生物材料（如细胞培养物、实验动物分泌物、动物血清等）支原体感染的检测。

它综合了几个优势：灵敏、特异、快速并且可以用直接用细胞培养上清液检测。本制品通过PCR方法检测培养细胞等生物材料中的支原体，

所用引物为根据支原体16S-23S rRNA序列保守区域设计，只特异性扩增支原体 DNA，检出灵敏度与特异性均较高。

PCR 扩增及电泳分析只需数个小时，操作方便简单。

 

产品信息：

 

组分编号	组分名称	规格	储存条件
-A	Green Taq Mix	250µl	-20℃
-B	ddH2O	250µl
-C	Positive Control Template	50µl
-D	Primers	50µl

 

 

 

 

使用说明：

请详细阅读使用说明后再开始相关实验。

待测细胞连续传代3次或培养至两周；

细胞达到80% confluency或以上的时候，取1ml上清，进行低速离心（300g，5min，4℃）；

离心结束后取950μl上清液，转移至新的无菌EP管中，以去除培养基中的细胞；

将上清液高速离心（12000g，10min，4℃），离心结束后，去除900μl上清，剩余50ul用以重悬沉淀（可能肉眼不可见）；

将重悬好的沉淀放置4度冰箱，作为PCR的模板备用；

根据下表，配制PCR反应液：

 

试剂	实验组	阳性对照	阴性对照
A	12.5µl	12.5µl	12.5µl
待测样品	5µl
C		5µl
B	5.5µl	5.5µl	10.5µl
D	2µl	2µl	2µl

 

注：为防止 Positive Control Template 污染，请将实验组和阴性对照组加完以后，最后再将 c液加入阳性对照组

PCR程序：

 

步骤	温度	反应时间	循环数
Step 1	95℃	5min	1
Step 2	94℃	30s	5
	50℃	30s
	72℃	35s
Step 3	94℃	15s	23
	56℃	15s
	72℃	30s
Hold	12℃	∞

 

制备DNA gel：称取一定量Argrose粉末，用1X TAE buffer配制成1.5%的DNA GEL；

待PCR反应结束后，取8-10μl的PCR 反应液（无需要加 loading buffer）直接进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物；

目的条带为518bp。示例如下。

推荐使用频率：

 

 

新细胞进入实验室	必检
液氮保存前	必检
定期常规	每月一次
发现污染后	每周一次
发现细胞异常	随时检测

 

 

注意事项：

使用本试剂前请仔细阅读本说明书全文。

操作时应佩戴口罩并尽量少说话，避免口腔中的支原体引起样品污染，造成假阳性；整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR 扩增应分区域进行，以避免交叉污染

实验时，试剂盒组分中的试剂使用前应充分融化并混匀（混匀时禁止激烈振荡，只需要进行上下倒置多次进行混匀）。

反应管中加好所有的试剂后，应尽快上 PCR 仪进行扩增，以免形成过多的二聚体。

细胞培养物中含有青霉素和链霉素等抗生物素不会影响本品的检测结果。如果用户需要进一步提高检测灵敏度，建议细胞在不含青霉素和链霉素等抗生素中进行培养 2-3 天后检测

为了您的健康，实验操作时请穿实验服和带一次性手套。