六色多重荧光染色试剂盒  (五标六色)

原理介绍: 酪酰胺信号放大(TSA，  Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶          ( HRP)  对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，  类似常规免疫组化的 DAB 显色方法  ，  TSA 技术同样采 用 HRP 标记的二抗，  同样有对应的“显色”步骤  ( HRP 催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，  产生 活化荧光底物，  活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，  使样品上稳定的共价结合酪胺荧光   素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP 复合物，  重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵 育，  换另一种酪胺荧光素底物，  如此往复就可实现多重标记。

TSA 详细原理是利用酪胺 Tyramide 的过氧化物酶反应(酪胺盐在 HRP 催化 H202 下形成共价键结

合位点)，  产生大量的酶促产物，  该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结   合，  这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，  结果使其检测信号得到 10-100 倍增强。简单 来说，  用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的 HRP  (而不是直接偶联荧光素)  ，  来催化后续 添加入体系的非活性荧光素。荧光素在 HRP 和过氧化氢的作用下被活化，  跟临近蛋白的酪氨酸残基   共价偶联，  使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，  前一轮非共价 结合的抗体被洗掉，  共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育 ， 周而复始。等到所有抗体孵育结束，  荧光素都结合好后，  最后去检测结果。  由于每次体系中都只有单 一抗体孵育，  因此无需担心抗体交叉反应，  以及一抗二抗种属匹配问题，  大大减少了实验设计时不同 种属抗体选择匹配的限制。也就是说，  如果用 TSA 技术，  同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性 高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以进行实验，  而且信号放大的倍数大大增强。   本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中以下一种或者多种：   480，   520，        570，   620，   690，   780。此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双 标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，  极大丰富了此试剂盒的内涵。

试剂盒组成：   520 荧光染料(绿光)(即用型，  5mL),-20℃；   570 荧光染料  (红光)  (即用型， 5mL)，  -20℃；   620 荧光染料 (即用型，  5mL)，  -20℃；   690 荧光染料 (即用型，  5mL)，  -   20℃；    780 荧光染料 (即用型，  5mL)，  -20℃；  TSA+增强剂，  100ul，   -20℃  (可选)  ；

高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗  ( 15mL)   4℃  (可选)  。

备注：   520 荧光染料 、 570 荧光染料、 620 荧光染料、 690 荧 光染料、 780 荧光染料 在-20 度下，  均为固体，  使用之前需解冻。

TSA+增强剂使用方法：  TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号放大液的放大信号 5-10 倍，  TSA+增 强剂：  荧光放大液=1:500，  使用 TSA+增强剂不是必须的选项，  可以根据具体的情况选择添加 或者不选择添加。

操作流程：

1、  石蜡切片脱蜡至水：  依次将切片放入二甲苯 Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇 Ⅰ5min-无水乙醇 Ⅱ。取出放在通风厨内，  酒精晾干后放入自来水中稍洗，  蒸馏水洗。