细胞系构建

细胞系（cell line）指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体，也指可长期连续传代的培养细胞。耐药细胞系是通过模拟癌症患者在化疗期间所经历的条件而开发的，与亲代细胞系相比，耐药细胞系表现出2-8倍的抗性。稳转细胞系指的是基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系，包括敲降（KD）细胞系、敲除（KO）细胞系、敲入（KI）细胞系。

 

一、耐药细胞系构建

1. 实验原理

细胞与低剂量的药物长期接触，引起细胞本身药物化学过程的改变，细胞膜上出现P-糖蛋白等耐药相关蛋白，使细胞逐渐对药物耐受。具有抗性的细胞大量繁殖并产生抗性后代，随着药物浓度的递增，其耐受程度逐渐加强，从而构建出对特定药物产生耐药性的细胞系。

 

2. 实验步骤

2.1 取对数期的细胞，以1×105个细胞/孔的密度铺板于96孔板，过夜培养后检测药物的半抑制浓度（IC50）；

2.2 取处于对数生长期的细胞（汇合度80%-90%），加入起始浓度为低浓度（建议为亲本细胞株的IC50的1/10-1/5）的药物进行处理，并置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养；

2.3 待细胞密度达到50%时，弃去培养液，PBS清洗2遍，更换不含药物的培养基继续培养；

2.4 细胞生长密度再次恢复至80%-90%时，重复上述药物处理6-8次；

2.5 待细胞在此浓度稳定生长后，依次提高药物浓度，并按照同样的方式进行处理，直到细胞能够在最终的药物浓度稳定生长，获得耐药细胞系；

2.6 检测耐药细胞株的IC50，并计算耐药指数（resistance index, RI），RI=耐药细胞系的IC50/亲代细胞系的IC50，RI>5则认为耐药细胞系的耐药性符合耐药株的要求。

 

3. 实验结果示例

 

在相同的药物及药物浓度处理下，耐药细胞HCT116/b-AP15比母本细胞HCT116的细胞存活率及IC50都要高。 

 

 

二、KD/KO/KI稳转细胞系构建

1. 实验原理

将外源基因克隆到具有某种抗性的载体上，通过转染宿主细胞，外源基因整合到宿主染色体上，用载体中所含抗性基因进行筛选即可得到成功整合目的基因的细胞系。慢病毒感染方法是目前最常用的稳定细胞系构建方法，其具有高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广，感染效率高的优势，且与细胞染色体整合而不发生基因重排，是制备稳定细胞系的理想方法。

 

 

2. 实验步骤

2.1 将目的基因构建到合适的慢病毒载体上，利用293T细胞进行慢病毒包装，获得含目的基因的慢病毒；

2.2 转染前24 h进行细胞铺板，转染时细胞密度控制在80%左右；

2.3 第二天加入适量病毒悬液感染细胞，并置于37 ℃，5% CO2培养箱中孵育；

2.4 24 h后用新鲜培养基替换含有病毒的培养基，并继续培养；

2.5 在转染3-4天后开始加药筛选培养，直至显微镜下观察荧光细胞比例为100%，获得稳转细胞系。

 

3. 实验结果示例

带有GFP基因的病毒感染细胞后，在荧光显微镜下可以观察到大量的细胞表达荧光，获得大量的稳转细胞。

 

参考文献

[1] Tandon N, Thakkar KN, LaGory EL, Liu Y, Giaccia AJ. Generation of Stable Expression Mammalian Cell Lines Using Lentivirus. Bio Protoc. 2018 Nov 5;8(21):e3073.

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[3] Maes ME, Colombo G, Schulz R, Siegert S. Targeting microglia with lentivirus and AAV: Recent advances and remaining challenges. Neurosci Lett. 2019 Aug 10;707:134310.

[4] Amaral MVS, DE Sousa Portilho AJ, DA Silva EL, DE Oliveira Sales L, DA Silva Maués JH, DE Moraes MEA, Moreira-Nunes CA. Establishment of Drug-resistant Cell Lines as a Model in Experimental Oncology: A Review. Anticancer Res. 2019 Dec;39(12):6443-6455.

[5] Li HL, Xie SM, Zhang L, Cai CJ, Wang W, Huang J, Wang DY, Wen DP, Deng QH, Zhong NS, He JX. Establishment and characterization of a new drug surviving cell line Am1010, derived directly from muscle metastases of a human lung adenocarcinoma patient with multi-drug-resistance to cisplatin, taxol, and gefitinib. Acta Pharmacol Sin. 2010 May;31(5):601-8.