外泌体内吞示踪

外泌体是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；参与细胞之间的交流，物质的运输以及正常生理过程的维持，此外还与疾病的产生有关。外泌体内吞示踪是用示踪剂 (如有机染料、荧光蛋白、造影剂、核素等) 标记外泌体，用特定的影像学方法对动物体内外泌体进行追踪，从而观察外泌体在体内的生物学行为和检测靶细胞内吞外泌体的情况，并有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前对于外泌体的常用标记方法是亲脂性染料，影像学的常用方法是光学成像。

1. 实验原理

用于外泌体标记的亲脂性染料，可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光。其中常用的膜蛋白荧光染料是PKH67（绿）/PKH26（红），与分离的外泌体孵育后，可以标记上外泌体，使外泌体带上荧光，通过加入荧光标记好的外泌体与靶细胞进行孵育，荧光显微镜检测靶细胞中荧光富集情况，以判断靶细胞是否可以内吞外泌体。影像学的光学成像分为生物发光成像和荧光成像。其中生物发光成像是由自身合成的荧光素酶催化人为注射的荧光素底物，而产生的化学发光成像方法，需要超灵敏相机来检测。而荧光成像则是利用有机染料或荧光蛋白在外部光源的激励下发出信号而成像。

2. 实验步骤

2.1 亲脂性染料标记实验

2.1.1 外泌体蛋白定量：取适量外泌体进行BCA浓度测定来确定外泌体蛋白量。

2.1.2 染料工作液制备：用Diluent C将PKH67/PKH26 linker储存稀释液稀释10倍，配制浓度为100 μM的染料工作液。 

2.1.3 外泌体染色：在外泌体中加入染料工作液（建议10-200 μg外泌体蛋白量加入50 μL染色工作液、10-200 μg外泌体蛋白量加入50 μL染色工作液）。加入染料工作液后，通过涡旋振荡器混匀1 min，再静置孵育10 min。向孵育后的外泌体-染料复合物中加入10 mL的1 × PBS，混匀。按照外泌体提取方法再次提取外泌体以去除多余染料，最后取200 μL的1 × PBS重悬沉淀物，沉淀即为荧光标记好的外泌体。

2.1.4 通过加入荧光标记好的外泌体与靶细胞进行孵育，孵育时间依实验而定。

2.1.5 荧光显微镜下观察荧光富集情况。

2.2 荧光成像实验原理与步骤同染料标记相同，但是在荧光量子化、颜色和半衰期等方面有所不同。有机染料的发射波长范围为502至734 nm，在选择合适的探针进行外泌体标记时提供了多种选择。

2.3 生物发光成像：根据实验需要通过尾静脉注射、皮下移植、原位移植等方法接种用荧光酶标记的细胞，同时在不同时间注射底物激发发光，来展现细胞来源外泌体进行成像。

3. 结果示例

L6细胞共培养后被PKH67标记的外泌体（绿色）吸收。PKH67标记的外泌体定位于L6细胞的细胞核中。

参考文献

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