细胞名称

人胚胎干细胞

货号

U80229

种属

人

细胞来源

从ATCC/中科院/协和医院等地引进

生长特性

圆形克隆，贴壁

培养条件

培养基：人胚胎干细胞完全培养液 ，推荐使用UBI的特级胎牛血清（U11-059A）

温度：37℃ 气相：95%空气，5%二氧化碳

传代

1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的复苏

2. 人胚胎干细胞的复苏（以 T25 为例）

a. 水浴锅 37°C 预热，将人胚胎干细胞完全培养液温浴到 37°C。

b. 从液氮中取出冻存的人胚胎干细胞，放入水浴锅中，快速晃动使管中的细胞尽 快融化，仔细观察，待剩最后一块冰晶时，快速取出。

c. 用 75%酒精擦拭消毒冻存管口的外表面，在超净台中打开冻存管，将细胞冻存 悬液转移至含有 4ml 完全培养基的离心管中，注意减少气泡的产生。

d. 为了减少细胞损失，再往冻存管中加入 1ml 完全培养基，稍微吹打，收集至离 心管中。

e. 将细胞悬液离心 1000rpm/5min。离心期间，将 MEF 细胞换用人胚胎干细胞完 全培养液。

f. 离心后，去除上清，加入 1ml 人胚胎干细胞完全培养液，，轻轻吹打混匀。使 克隆变小。

g. 将人胚胎干细胞按 10000-40000 个活细胞/cm2的密度接种到已经换好液的 MEF 细胞中，轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布。放入 37°C，5%CO2 的培养箱中培养。

h. 复苏后第三天，给复苏的细胞换用新鲜的人胚胎干细胞完全培养基（已 37°C 预热）。每天换液。

3. 人胚胎干细胞的传代

a. 当人胚胎干细胞的克隆较大，出现分化或即将分化；或者由于复苏或传代接种 的密度的问题，即将出克隆间融合，就必须传代。

b. 传代前准备，提前 1-3 天准备 MEF 细胞

c. 将人胚胎干细胞完全培养基，小鼠胚胎成纤维细胞完全培养液，Ⅳ型胶原酶， PBS 预热至 37°C。

d. 吸弃培养瓶的旧培养液，加入 2ml PBS 洗涤细胞，吸弃 PBS，加 1mlⅣ型胶原 酶覆盖细胞表面，消化，显微镜下观察，约 70-80%左右的细胞变圆后，用手轻拍 培养瓶的壁，使细胞脱落下来。

e. 立即加入 1ml 人胚胎干细胞完全培养液，终止消化。轻轻吹打使克隆变小。 f. 将细胞克隆悬液转移到 15ml 离心管中。沉降

i. 沉降期间，将 MEF 细胞换用人胚胎干细胞完全培养液。

j. 沉降后，去除上清，加入 1ml 人胚胎干细胞完全培养液，混匀。

k. 将人胚胎干细胞按 10000-40000 个活细胞/cm2的密度接种到已经换好液的 MEF 细胞中，轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布。放入 37°C，5%CO2 的培养箱中培养。

l. 传代 48h 后换液。

注意：一定要按照合适的密度进行接种，密度太稀则细胞长得慢，密度过密则容易 导致胚胎干细胞的分化。

保存

冻存条件：50%完全培养基+40%FBS+10%DMSO(备注：建议使用UBI的Cell Freezing Medium无血清冻存液（U80-025C），用4度保存的冷冻液直接重悬细胞，不能预热后使用。)

保存条件：液氮存储

供应限制

经供研究之用

常见问题及解决方案

1.培养瓶有破裂，培养液有漏液：细胞极大可能会污染，所以我们会及时安排帮老师解决。

2.收到细胞后尽快更换为含 10%血清的新鲜培养基，如因特殊情况需要继续使用原瓶培养基，请在原瓶培养基中额外添加 10%的血清（原瓶培养基的继续使用时间最长不宜超过 72 小时）

3.细胞漂浮：培养瓶不开封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。1-2小时后观察，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞活力正常，剩余漂浮的细胞可以去掉，留8-10ml培养液培养观察，细胞生长至汇合度80%，进行消化传代；如细胞还是不贴壁，将细胞离心收集转到新培养瓶，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察，我们的技术人员会一直跟踪指导，直到问题解决。