biotin-TUNEL细胞凋亡试剂盒

 

 

 

产品货号：B0068

存储条件：本产品应置于-20℃储存，组分 A、E、G 需避光，避免反复冻融。有效期见外包装。（注：组分 A、E、F、G 使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤，请立即用大量水冲洗。）

产品组分

	（20T）	（50T）
A.Biotin TUNEL Reaction Buffer	2x0.5 mL	5x0.5 mL
B.TdT酶	20 μL	50 μL
C.Streptavidin-HRP	20 μL	50 μL
D.Streptavidin-HRP稀释液	1 mL	2×1.25 mL
E.DAB显色液A	100 μL	250 μL
F. AB显色液B	1 mL	2×1.25 mL
G. AB显色液C	50 μL	125 μL
H.Proteinase K (2 mg/mL)	40 μL	100 μL
I.DNase I (2 U/μL)	5 μL	13 μL
J.10 × DNase I Buffer	100 μL	260 μL

 

产品简介

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体DNA 的降解， 这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为 180bp-200bp的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状Ladder图谱，本试剂盒采用TUNEL法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡细胞断裂DNA的3´-OH末端催化掺入生物素（Biotin）标记的dUTP (Biotin-X-dUTP)。随后和辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的Streptavidin(Streptavidin-HRP) 特异结合， 最后在 HRP 的催化下通过DAB 显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜观察并计数凋亡细胞。由于正常的或正在增值的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有 3´-OH 形成，很少能被染色。TUNEL法可以选择性的对凋亡细胞直接进行原位检测，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的DNA链断裂的细胞，是一种更快速、直接的检测手段。

使用方法：

实验材料（自备）

PBS 缓冲液（pH~7.4）

4%多聚甲醛（PBS 配制）

 

 

 

PBS 配制 0.3% H2O2（新鲜配制）

70%乙醇（自选）

脱蜡溶剂（石蜡切片样本）

注意事项：

1.荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。

2.在使用DAPI荧光封片剂的情况下，虽然可减缓淬灭，仍需尽量避光。

3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

实验步骤

1.样本准备：

（1）细胞样品

a. 可选：准备一份阴性对照样本（加入不含TdT酶的TUNEL反应液）。

b. PBS 清洗细胞两次。

c. 细胞固定：加入适量4%多聚甲醛（pH 7.4）溶液，4℃放置30min。

d. PBS清洗细胞两次。

e. 通透细胞：细胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透，室温放置 20 min。

f. PBS清洗细胞两次。

g.封闭细胞：每孔加入100μL左右的配制于PBS中的0.3% H2O2溶液，轻敲孔板使其充分覆盖细胞，室温避光封闭30min，用 1×PBS 清洗细胞 2 次；

（2）石蜡组织切片

a.室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次，每次5 min， 以彻底脱掉石蜡。

注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。

b.室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次，每次5 min。

c.室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇

（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗1次，每次5 min。

d.室温下，将切片浸没于纯水中漂洗3 min，再将切片浸没于1×PBS中漂洗3 min，用滤纸小心吸干切片样本周围液体。

e.用免疫组化笔围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。

f.按1: 100的比例，将2mg/mL的蛋白酶K溶液用1×PBS稀释至终浓度20µg/mL，在每个样本上滴加 100 µL，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育20min（蛋白酶K的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

注：蛋白酶K可以帮助渗透组织，时间短达不到通透效果， 但延长孵育时间可能导致切片脱落。一般情况下，厚度4µm孵育10min，厚度30µm孵育30min。

g.PBS浸润清洗切片两次，每次5min。

h.封闭：加入适量配制于PBS中的0.3% H2O2溶液（新鲜配制），室温孵育30 min，以灭活切片内源的过氧化氢酶。

 

 

 

 

 

i.PBS浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

（3）冰冻组织切片

a.将冰冻切片放置于室温的片架上，室温20 min，晾干。

b.将载玻片浸没在4%多聚甲醛溶液中，室温固定30 min。

c.PBS浸润清洗切片两次，每次5 min。

d.用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

e.按1:100的比例，将2 mg/mL 的蛋白酶K溶液用

1×PBS 稀释至终浓度20 µg/mL。每个样本上滴加 100 µL，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育10min（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，时间短达不到通透效果， 但延长孵育时间可能导致切片脱落。一般情况下，厚度4 µm孵育10 min，厚度30 µm 孵育30 min。

f.PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min。

g.封闭：加入适量配制于PBS中的0.3% H2O2 溶液（新鲜配制），室温孵育30 min，以灭活切片内源的过氧化氢酶。

h.PBS清洗样品3次，每次5min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

（4）阳性处理（仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL反应步骤）

a.按1:10的比例用 ddH2O 将10×DNase I Buffer 稀释成1×DNase I Buffer 备用。

b.滴加100 µL 1×DNase I Buffer 到已通透的样本上，室温平衡5 min。

c.用1×DNase I Buffer以1:100稀释DNase I (2 U/μL)，使其为终浓度20 U/mL 的工作液。

d.轻轻吸掉多余液体，加入100μL浓度为20 U/mL DNase I工作液，室温孵育10min。

e.轻轻吸掉多余液体，PBS 清洗样品2次。

2.TUNEL 反应

（1）配制TUNEL 反应液（即用即配）：

	1个样品	5个样品	10个样品
TdT 酶	1 μL	5 μL	10 μL
Biotin TUNEL Reaction Buffer	49 μL	245 μL	490 μL
TUNEL 反应液总体积	50 μL	250 μL	500 μL

 

（2）每个样品加入50μL TUNEL反应液，37℃避光孵育60min，组织样本需要2 h（阴性对照样品加入不含TdT酶的TUNEL反应液）。

注：50 μL Streptavidin-HRP 工作液适合涂片、切片或 96 孔板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一个孔，如果是 6 孔板， 建议使用 100 μL。为防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸发，建议在样品上覆上防蒸发膜。

（3）PBS 清洗反应后的样品3次，每次5 min。

 

 

3.Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制

（1）Streptavidin-HRP 工作液的配制（即用即配）：

	1个样品	5个样品	10个样品
Streptavidin-HRP	1 μL	5 μL	10 μL
Streptavidin-HRP稀释液	49 μL	245 μL	490 μL
Streptavidin-HRP工作液总体积	50 μL	250 μL	500 μL

 

（2）DAB 显色液的配制（即用即配）：

	1个样品	5个样品	10个样品
DAB显色液A	5 μL	25 μL	50 μL
DAB显色液B	42.5 μL	212.5 μL	425 μL
DAB显色液C	2.5 μL	12.5 μL	25 μL
DAB显色液总体积	50 μL	250 μL	500 μL

 

4.样品显色

（1）向样品滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，37℃避光 孵育30 min。

注：50 μL Streptavidin-HRP 工作液适合涂片、切片或 96 孔 板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一个孔，如果是 6 孔板， 建议使用 100 μL。为防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸发，建 议在样品上覆上防蒸发膜。 

（2）PBS清洗样品3次，每次5min。

（3）向样品滴加50μL DAB 显色液，室温孵育5-30 min或在显微镜下根据颜色的发展情况掌握染色时间。

 注：如果显色很强可短于 5 min 即停止显色，如果显色很弱， 可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。 

（4）PBS 清洗样品3次，每次5 min。

（5）选做：用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用PBS清洗 3 次。

（6）直接光学显微镜下观察。针对石蜡切片，如果需要封片，使用95%乙醇脱水5 min，再用100%乙醇脱水2次， 每次3min，再用二甲苯透明2次，每次5min。