四色多重荧光染色试剂盒（三标四色）

原理介绍: 酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法   ，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤（HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

TSA详细原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为一下其中一种或者多种：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大丰富了此试剂盒的内涵。

试剂盒组成：TYR-520荧光染料(绿光)(即用型，5mL),-20℃；TYR-570荧光染料（红光）(即用型，5mL)，-20℃； TYR-690荧光染料(即用型，5mL) ，-20℃；TSA+增强剂，50ul， -20℃（可选）；

高敏多聚hrp山羊抗兔二抗（5mL） 4℃。   

备注：TYR-520荧光染料 、TYR-570荧光染料 、TYR-690荧光染料 在-20度下 ，均为固体，使用之前需解冻。

TSA+增强剂 使用方法：TSA+增强剂 能够进一步增强荧光信号放大液的放大信号5-10倍，TSA+增强剂：TYR荧光放大液=1:500，使用TSA+增强剂不是必须的选项，可以根据具体的情况选择添加或者不选择添加。

操作流程：

1
石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ。取出放在通风厨内，酒精晾干后放入自来水中稍洗，蒸馏水洗。

2
抗原修复：组织切片置于盛满PH 9.0 EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（也可以用高压1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他热修复方法）。中火8min，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定）。

3
阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4
BSA封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3%BSA-PBS（或者其他封闭液）均匀覆盖组织，室温封闭30min。

5
加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37度1-2h。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6
加hrp二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织，避光室温孵育50min，PBS洗三次。

7
荧光染料反应：TYRXXX荧光染料反应 2min-15min，PBS洗三次。

8
重复2-7步骤（换用另外一种TYRXXX荧光染料）

9
DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

10
封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

11
镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

文章引用试剂盒/方法：Co-staining of A, B and C was performed using a Four-color Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.