帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种发生于人类中老年中枢神经系统的疾病,动物并不自然发生该病。给动物使用不同的神经毒素如6-羟基多已胺。甲基an非他明、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢砒啶(MPTP)以及Fe2可模拟出该病的某些特征。PD的运动症状和相应的病理变化可在动物如小鼠、大鼠、灵长类等观察到,大量的研究表明,中脑双侧苍白球和黑质DA能神经元坏死是PD的主要病理学改变。

1.操作步骤

Wistar大鼠,雌雄均可,体重200-250g。10%水合氯醛(4℃存放,不宜过久)3ml/kg,腹腔注射麻醉。约5分钟动物麻醉平稳后,将动物俯卧位固定于小动物立体定位仪上。上耳杆时注意对称和稳固,上牙齿固定于门齿棒上,并用压杆压往鼻骨。剪去头部顶毛,切开或剪开皮肤,范围为:两外耳道中线连线前后各0.5厘米。用眼科剪去除颅骨表面的结缔组织膜或用手术刀刮去,以使颅骨表面尽可能干净。少量出血时用于棉球压迫止血。稍候干燥,可见到颅骨表面呈白色,前囟、后囟清晰可见。

将注射用的10ul或25ul Hamilton微量注射器固定于立体定位注射仪上颅骨正上方,准备好牙科钻头,钻头直径0.8m1。损毁部位为单侧黑质或内侧前脑束。以前囟为标准参考点,进针点可选择左侧或右侧。有时前囟不清晰,可分别按压两侧的顶盖骨和额骨,在“按压一放松”的过程中,便可清晰见到前囟。依Paxson《The Rat Brain》图谱,注射部位的坐标为:第一点(mfb),门齿棒高于耳杆3.4mm。前囟后4.0mn1,中线左旁开0.8mm,颅骨表面下8.0mm:第二点(SNC),门齿棒低子耳杆2.3mm,前囟后4.l4mm,中线左旁开1.2mm,颅骨表面下7.8mm。用牙科钻钻开颅骨恰至软脑膜表面。用小号针头轻轻挑破软脑膜。此时注意最好不要用钻头直接钻破软脑膜,以免大量出血。每点注射6-OHDA溶液4ul(12ug),注射速度为lul/min,留针10分钟,缝合皮肤,将术后的大鼠置于安静保温处直至清醒,自由进食饮水。

2.模型检测

行为学检测:依照国际通用的标准(Hudson等,1993),对注射过6-OHDA的大鼠,于术后第二周开始筛选。即每周一次腹腔注射APO(0.25mg/kg体重)诱导其向健侧旋转,共筛选3周,每次记录30分钟,旋转210圈以上者为PD大鼠。

病理学检查:模型成功的动物,10%水合氯醛过量麻醉,开胸,经心脏从胸主动脉滴入(或经恒流泵输入)0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.3-7.4))或l%的多聚甲醛(磷酸缓冲液配制)100-150m1,然后继续输入4%多聚甲醛(磷酸缓冲液配制)200ml以进行内固定。全脑取出后,继续在4%多聚甲醛溶液中浸泡24小时以上进行外固定。然后经30%蔗糖置换后,OCT包埋,快速冰冻切片,片厚10um。常规病理学检查,或进行酪氨酸羟化酶(tyrosine droxylase,TH)的免疫组化染色,观察DA神经元的数目。可见损伤侧黑质致密部DA神经元明显缺失,胶质细胞增生,残留神经细胞固缩,部分胞浆明显肿胀和空泡变。同侧纹状体内DA神经元末梢的TH反应性大为降低甚至消失。生理盐水对照组上述部位DA神经元与未受损侧相比,无显著差别。尾核、豆状核可无明显特异性改变。

生化检查:动物迅速断头取脑,速冻至-70℃。采用立体定位方法穿刺得到损伤侧与未损伤侧纹状体组织标本(湿重大约0.3mg)。高效液相电化学法(HPLC-ECD)检测中脑黑质、纹状体DA、高香草酸(HVA)和3,4-DOPAC的含量。可见受损侧上述部位的DA、HVA、DOPAC含量均降低。

实验数据统计分析方法:旋转行为及DA等含量测定结果采用配对,检验。