荧光素酶报告实验（Luciferase reporter assay）

 

荧光素酶报告基因（Luciferase reporter）检测是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光，可通过酶标仪等设备测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光，常应用于miRNA靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。

 

1. 实验原理

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把目的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。由于单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。

2. 实验原理图

2.1 miRNA与靶基因mRNA互作

2.2 转录因子与启动子互作

3. 实验步骤

3.1 样品准备（根据不同实验目的设计不同分组，本实验以miRNA靶基因验证为例）

3.1.1 将细胞按50%的密度接种到细胞培养12孔板内。

3.1.2 待细胞长至约70%时转染萤光素酶报告基因质粒，每个样品设置3个复孔，分组4组，空白组（转染试剂+细胞）、质粒组、质粒+miRNA NC组、质粒+miRNA mimics组。

3.1.3 配制质粒组：按照每孔50 ng质粒，同时每孔20 μL无血清培养基计算需用量，标记为A。

3.1.4 配制miRNA NC/mimics：miRNA NC/mimics的终浓度为20 nM，同时每孔20 μL无血清培养基计算需用量，分别标记为B、C。

3.1.5 配制对应转染试剂：按照每孔0.5 μL转染试剂，同时每孔20 μL无血清培养基计算需用量，标记为D。

3.1.6 稀释好的四组试剂常温孵育5 min。

3.1.7 将稀释好的质粒DNA和miRNA mimics分别和对应转染试剂混匀，常温孵育20 min。

3.1.8 将3.1.7步骤中试剂对应加入孔中。

3.1.9 转染6 h后，换新鲜完全培养基。

3.2 双报告基因检测

3.2.1 质粒共转染36-48 h后，弃去培养基，用100 μL 1×PBS清洗细胞。

3.2.2 倾斜12孔板，吸干剩余的PBS。

3.2.3 去离子水将5×PLB(裂解液)稀释成1×PLB（现配现用），使用前放到常温。

3.2.4 每孔加50 μL稀释好的 1× PLB，置摇床振摇20-30 min以保证裂解缓冲液完全裂解细胞。

3.2.5 选用白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤3.2.4的上清液10 μL，加入100 μL预先混好的Luciferase Assay Reagent II，2 s后测数据，检测荧光素酶反应强度。

3.2.6 测定结束后，每孔添加100 μL预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2 s后，测数据，检测内参海肾荧光素酶反应强度。

3.2.7 记录读数，每个样品会有3个数值：RLU1-萤火虫荧光素酶反应强度，RLU2-内参海肾荧光素酶反应强度，计算两组数据比值，即RLU1/RLU2。

4. 结果示例

在该结果中，miRNA-145-5p处理后的ARPC5-WT和MAP4K4-WT的luciferase活性均降低，表明其为miMRNA-145-5的靶基因

 

参考文献

[1] Lomakina GY, Modestova YA, Ugarova NN. Bioluminescence assay for cell viability. Biochemistry (Mosc). 2015 Jun;80(6):701-13.

[2] Nieuwenhuijsen BW, Huang Y, Wang Y, Ramirez F, Kalgaonkar G, Young KH. A dual luciferase multiplexed high-throughput screening platform for protein-protein interactions. J Biomol Screen. 2003 Dec;8(6):676-84.

[3] Xu YZ, Kanagaratham C, Jancik S, Radzioch D. Promoter deletion analysis using a dual-luciferase reporter system. Methods Mol Biol. 2013;977:79-93.

[4] Ghazawi I, Cutler SJ, Low P, Mellick AS, Ralph SJ. Inhibitory effects associated with use of modified Photinus pyralis and Renilla reniformis luciferase vectors in dual reporter assays and implications for analysis of ISGs. J Interferon Cytokine Res. 2005 Feb;25(2):92-102.

 

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