GFP-Nanoab-Agarose

 

货号：GNA-25-500/GNA-50-1000

储存条件：可在4℃保存1年，或在-80℃长期保存，避免反复冻融。

产品描述

偶联anti-GFP纳米抗体的琼脂糖珠子用于免疫沉淀GFP融合蛋白。

产品优势

没有普通抗体的轻链和重链；

高亲和力：解离常数达到pM级别；

高载量：10μl的slurry可以结合2-4μg GFP蛋白；

较短的孵育时间，结合5-30min即可；

应用范围

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性测定、质谱分析等；

特异性

可以结合GFP、EGFP、YFP和EYFP等。

产品特性

存储缓冲液：PBS(含有20%乙醇)。

实验步骤：

收集细胞：

每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 个表达绿色荧光蛋白融合蛋白的细胞，可根据绿色荧光蛋白融合蛋白表达量适当调整细胞数。吸出培养基，向培养皿中加入预冷的1×PBS，漂洗2次，利用细胞刮或胰酶消化收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500g离心3分钟并丢弃上清液。

植物组织裂解处理： 

取适量植物组织样本（叶片等）放置于冷冻液氮中，之后将冷冻后得植物组织样本放于研钵进行研磨，尽可能充分研磨破坏其细胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（需加蛋白酶抑制剂）进行裂解，为了提高裂解效率，可加入200ul 玻璃粉充分震荡 30min，裂解完成后12000 rpm，离心30min，吸取上清置新的离心管中，弃去沉淀。

动物细胞裂解：

1．在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，用500μl预冷的裂解缓冲液重悬细胞。

2．置于冰上30分钟，可每10分钟充分吹打一次。

3．4℃，20,000g离心15分钟，将裂解产物（上清）转移到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。注意：此时细胞裂解产物可长期保存于-80℃。

平衡珠子：

4．振荡充分混匀GFP-Nanoab-Agarose， 吸取20μl该产品到500 μl预冷的裂解缓冲液中，4℃，2,500g离心2分钟，丢弃上清液。（此步骤可选）   

结合蛋白

5．将平衡好的GFP-Nanoab-Agarose加入到细胞裂解产物中（如果未做第4步，可在细胞裂解产物中直接加入20μl该产品），于4℃旋转混合结合5-30min。如果需要，留存50μl的裂解产物进行免疫印迹分析。
6．4℃，2,500g离心2分钟，丢弃上清液。如果需要，留存50μl上清液进行免疫印迹分析。

清洗珠子：

7．用500μl预冷的裂解缓冲液中重悬6中的GFP-Nanoab-Agarose，4℃，2,500g条件下离心2分钟，丢弃上清液并重复洗涤2次。

洗脱蛋白：

方法一：
8．加入20μl 2×SDS-sample buffer重悬GFP-Nanoab-Agarose。95℃，加热10min，2,500g离心2分钟收集上清，收集的产物可进行SDS-PAGE及免疫印迹分析。

方法二：
9．替代步骤8的可选步骤：加入50μl 0.2 M pH2.5的甘氨酸洗脱结合的蛋白，孵育时间30秒，期间不断混匀，2,500g离心2分钟收集上清，为了中和酸性的甘氨酸，需加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。

 

可选方案

方案一：
如需进行GFP融合酶的活性检测，无需洗脱，可以直接检测。

方案二：
如需进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，主要用于含有GFP融合蛋白的蛋白质/DNA相互作用的实验。染色质免疫沉淀一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化以及DNA的鉴定。其中前期细胞固定，染色质断裂不变；然后接着直接进入说明书的第5步，加入细胞裂解产物后，DNA-蛋白质复合物结合到GFP-Nanoab-Agarose上；
进入第6和7步，分离得到复合物；进入第10步，得到洗脱的复合物；后期交联反应的逆转，DNA的纯化及DNA的鉴定等同于普通的ChIP实验。RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验步骤同上。

方案三：
GFP-Nanoab-Agarose 不仅可以用于在体内外检测和验证蛋白质之间的相互作用， 也可以结合质谱分析筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步骤同免疫沉淀法，得到洗脱的复合物后，然后进行SDS–PAGE分析，用考马斯亮蓝或者银染的方法染色后，切下未知蛋白的条带，用质谱技术鉴定未知蛋白。