Buccutite 蛋白交联 抗体标记试剂盒提供了一种以微观方式标记抗体的便捷方法。蛋白质 - 蛋白质缀合通常用双功能接头如SMCC进行。 SMCC的一端（通过NHS酯）与氨基酸赖氨酸和N-末端中发现的胺（-NH2）反应，另一端（通过马来酰亚胺）与氨基酸中发现的硫醇基团（-SH）反应。半胱氨酸。然而，SMCC修饰的蛋白质极不稳定并且通常是自身反应性的，因为蛋白质通常含有胺和硫醇基团，其引起显着量的均聚交联。此外，量化蛋白质上马来酰亚胺基团的数量是相当困难和繁琐的。 AAT Bioquest开发了一种方便有效的交联方法，将两种生物分子连接起来，具有高结合率。我们的方法使用一对交联剂：Buccutite MTA和Buccutite FOL。将MTA添加到一种蛋白质中，而将FOL添加到另一种蛋白质中。通过混合Protein-1-Buccutite MTA和Protein-2-Buccutite TM FOL引发蛋白质 - 蛋白质交联反应。这种交联反应在非常温和的中性条件下进行，不需要任何催化剂，并且它坚固且有效。Buccutite 蛋白交联抗体标记试剂盒是美国AAT Bioquest研发的产品。

实验方案

操作步骤

进行Protein-1 MTA反应

1.直接在Buccutite MTA（组分A）中加入105μL蛋白质-1溶液，并反复移液，以重复数次，或将小瓶涡旋数秒钟。

2.在室温下将蛋白质1-Buccutite™MTA抗体混合物在室温下旋转30-60分钟，然后将其旋转。或摇晃更长的时间。

3。通过脱盐柱纯化蛋白-1-Buccutite™MTA。

4。脱盐后计算出蛋白1-Buccutite™MTA的浓度为75％。（例如，蛋白质分离后以75μs沉淀，以100μm的纯度回收蛋白质，以粗粉回收。）

进行Protein-Buccutite™2 FOL反应

1.直接在Buccutite™FOL（组分B）中加入10⁵μL蛋白质2溶液，涡旋小瓶几秒钟。

2.保持蛋白质2-Buccutite™FOL反应混合物在室温下放置30-60分钟。

3.通过脱盐柱纯化Proteinin-2-Buccutite™FOL。

4.计算脱盐后Protein-2-Buccutite™FOL的浓度为75％

纯化抗体-Buccutite MTA溶液

1将柱（来自步骤准备旋转柱用于抗体-Buccutite MTA纯化）置于干净的收集管（1.5mL，未提供）中。 小心地将样品（~105μL，来自Step Antibody-Buccutite MTA反应）直接加载到色谱柱中。

2加载样品后，加入5μL1XPBS（pH 7.2-7.4），使总体积为110μL。 将柱以1,000xg离心5-6分钟，并收集含有所需抗体-Buccutite MTA溶液的溶液。

进行Protein-1 and Protein-2蛋白交联反应

1交联反应是通过将蛋白质1-Buccutite™MTA和蛋白质2-Buccutite™FOL混合在所需的摩尔比下开始的。通常，将Buccutite™FOL修饰的蛋白质2与Buccutite™MTA修饰的蛋白质-1在1.5-2.0摩尔浓度下的混合使用，可以使蛋白质在整个过程中随成本降低。

2将混合物在室温下旋转1至2小时，或在4°C的温度下过夜。在4°C的条件下可以存放。脱盐是可选操作。

可选：共轭纯化和分析

1.可以使用4-12％Bis-TisProteinGelina SDS运行缓冲液系统分析少量反应混合物（例如2〜4mg）以检测结合结果。

2.结合反应混合物包含所需的结合物与少量未连接的蛋白质2混合使用，如果需要，可以按需要使用适当的色谱图和纯度（所需的大小）。

准备离心柱进行纯化

1.将提供的离心柱（D）颠倒数次，以储存沉淀的凝胶并除去任何气泡。

2.摘下吸头，然后将色谱柱放入清洗管中（2 mL，未提供）。取下盖子，使多余的填料缓冲液在重力作用下流到凝胶床的顶部。如果色谱柱没有开始流动，则将盖子推回色谱柱，然后再次将其取下以开始流动。丢弃排干的缓冲液，然后将色谱柱放回清洗管中。如果将色谱柱放入12 x 75 mm试管（未提供）中，请立即离心。

3.在1,000 x g的旋转桶式离心机中离心2分钟（请参阅“离心注意事项”部分）以除去包装缓冲液，弃掉缓冲液。

4.将1-2 mL 1X PBS（pH 7.2-7.4）应用于色谱柱。每次施加PBS后，使缓冲液在重力作用下流失，或将色谱柱离心2分钟以除去缓冲液。丢弃收集管中的缓冲液，重复此过程3-4次。

5.在1,000 x g的旋转桶式离心机中离心2分钟（请参阅“离心注意事项”部分）以除去包装缓冲液。弃掉缓冲液。

6.将色谱柱放在干净的收集管（1.5 mL，未提供）中。小心地将样品（〜105 µL）直接加到色谱柱中。

7.上样后，加入10 µL 1X PBS（pH 7.2-7.4），以1,000 xg离心色谱柱5-6分钟，并收集含有所需蛋白-1-Buccutite™MTA溶液或Protein-2-Buccutite™FOL溶液。

离心注意事项

1.旋转柱（组分D）可放入2 mL微量离心管或12 x 75 mm试管中，以在离心过程中收集样品。将2 mL微量管与色谱柱一起用于初始色谱柱平衡步骤。

2.可产生小力为1,000 x g的摆动式离心机适用于Bio-Spin色谱柱。在特定转速下产生的重力是微量离心机转子半径的函数。有关从每分钟转数（RPM）转换为离心力或g力的信息，请参阅回转铲斗离心机说明手册。或者，使用以下公式来计算达到1,000 x g的重力所需的以RPM为单位的速度：

RCF (x g) = (1.12 x 10^-5)×(RPM)×2×r 

（①RCF是相对离心力②r是从转子中到Bio-Spin柱中间的半径，以厘米为单位③RPM是转子的速度）

图示

用1ug / ml小鼠IgG对照（绿色）或1ug / ml小鼠抗人HLA-ABC（W6 / 32 mAb）（红色）染色的HL-60细胞的流式细胞仪分析，然后是山羊抗小鼠IgG-用Buccutite™快速PE-Cy5串联抗体标记试剂盒（Cat＃1315）制备的PE-Cy5共轭物。