技术原理

 

细胞凋亡是细胞的基本特征之一，在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。

 

 

在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

 

 

碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

 

 

实验方法

 

Step1：细胞培养

Step2：转染或药物处理

Step3：细胞收集

Step4：加凋亡试剂

Step5：上机检测

 

案例展示

 

 

 

 

技术总结

 

1、考虑到进行流式时需要用到对照组细胞设置空白组（用于调节电压）和单染组细胞（用于调节补偿），因此要求该组细胞量较其他组多

2、如发现细胞密度偏低，细胞量较少，则适当增加离心时间。收集细胞时，应该连同上清一起收集，同时胰酶消化时间不宜过长，否则容易引起假阳性

3、检测细胞经过转染等处理后可能会带有自发荧光，应注意选择凋亡试剂盒的颜色通道 如：带绿色荧光时，应选择7AAD试剂盒

4、细胞铺板应选择细胞状态良好的时候进行，且避免反复吹打

5、流式检测细胞样本：细胞样品准备时，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，不得使用细胞刮刀进行操作，胰酶消化细胞时切忌消化过头或没有完全打开细胞间隙

 

送检与交付标准