外泌体分离

外泌体（Exosomes）是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150 nm），其特指直径在40-100 nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，这些外泌体通过转运关键蛋白和遗传物质，在细胞通讯和表达遗传中发挥着关键作用。且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。通常采用离心法来进行外泌体分离。

1. 实验原理

利用分子的大小比重物理原理和多聚物的沉淀原理，使用离心法分离外泌体是至今为止最常用的方法。 此方法可大量提取、成本低、操作简单、耗时短。分离的外泌体可作为治疗靶标、药物或基因载体以及作为疾病标志物的应用，还在细胞与细胞间的物质和信息传递中起着重要的作用。

2. 实验步骤(不同样品分离步骤不同，以尿液为例）

2.1 将冻存品于25 ℃水浴中解冻，将完全融化后的样品置于冰上。

2.2 取25 mL尿液转移至离心管中，4 ℃，3000 g离心10 min，去除细胞碎片；若沉淀较多，可重复离心多次至无明显沉淀，取离心上清液。

2.3 离心上清液转移至50 ml离心过滤柱中；4 ℃，3000 g离心10 min，取过滤柱下室液体；若上室中有残留液体，可重复本步骤以获得更多样本量。

2.4在离心过滤后的上清液中加入Exosome Concentration Solution （ECS试剂），25 mL尿液加入5 ml ECS。

2.5 涡旋振荡混匀1 min后放置于4 ℃静置2 h。

2.6 取出装有混合液的离心管于4 ℃，10000 g离心1 h，marker笔标记沉淀位置，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒，静置1 min后，再次吸弃上清。

2.7 取Exosome Solution Buffer（ESB试剂）均匀吹打离心沉淀物，25 mL尿液加入0.5 mL ESB，待其溶解后，将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中。

2.8 4 ℃，12000 g，离心5 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。分装保存于-80 ℃；便于后续实验。

3. 结果示例

示意图（过滤法）：首先去除细胞和细胞碎片，其次，过滤掉游离蛋白，浓缩样品。最后，去除大于100 nm的细胞外囊泡，得到外泌体。

参考文献

[1] Xu D, Tahara H. The role of exosomes and microRNAs in senescence and aging. Adv. Drug Deliv. Rev. 2013;65:368–375.

[2] Lobb, R. J. et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4 27031 (2015).

[3] Vergauwen, G. et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).

[4] Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., & Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolationfrom plasma. J Extracell Vesicles. 427269 (2015).