RNA pull-down实验

 

RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。通过该实验可以富集并鉴定或验证与目标RNA有相互作用的蛋白质。1. 实验原理

RNA沉降（Pull down）主要是检测蛋白质与RNA之间的相互作用。RNA pull down 是使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成 RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。收集从磁珠上洗脱下来的蛋白质，可通过质谱和Western Blot来确定和验证与RNA互作的蛋白。

2. 实验流程图

 

3. 实验步骤

3.1 生物素探针标记RNA

3.1.1 取出RNA 3' End Desthiobiotinylation试剂盒，将试剂盒中的PEG及DMSO置于常温，其余组分置于冰上融化；

3.1.2 依照RNA母管含量，用DEPC水溶解RNA，将浓度调整至10 μg/管，用10 μL DEPC水溶解。同时溶解试剂盒中Control RNA作为阴性对照；

3.1.3 取对照RNA及目标RNA各5 μL，放于200 μL的PCR管中，每管可加1 μL DMSO，混匀后置于PCR仪上，85 ℃，5 min，然后立即置于冰上5 min；

3.1.4 按照试剂盒说明书配置反应体系

3.1.5 混匀上述反应体系，之后放至PCR仪内，16 ℃，4 h至过夜。反应时间的延长可提高连接效率；连接反应结束后，向每管加400 μL nuclease free-water；

3.1.6 每管加300 μL酚氯仿提取标记成功的RNA；涡旋后最大转速离心15 min，小心将上层水相移取到新的EP管中；

3.1.7 加10 μL 5 M NaCl，2 μL糖原，以及600 μL预冷的100%乙醇，放于-20 ℃或-80 ℃沉淀，可沉淀过夜。

3.2 准备细胞裂解液

3.2.1 细胞培养在15 cm培养皿中，当细胞长至80-90%时，弃去培养基，用预冷的PBS洗3次，吸去上清；

3.2.2 每个培养皿中加入200 μL cell lysis buffer；

3.2.3 用细胞刮将细胞刮下，转移至EP管，冰上放置30 min；

3.2.4 离心，4 ℃，3000 rpm，离心10 min；

3.2.5 将上清转移至新的EP管中，置于冰上；加200 U/mL RNase Inhibitor;

3.2.6 取10-20 μL左右上清至新管中，作为实验input。

3.3 RNA沉淀

3.3.1 将沉淀过夜的RNA取出，4 ℃，最大转速离心30 min，离心后可见管底的白色沉淀为RNA；

3.3.2 小心移取上清，用1 mL 70%乙醇洗涤，8000 rpm 离心10 min,之后吸净管内液体，空气中晾干RNA；

3.3.3 每管加20 μL nuclease free-water溶解RNA，之后将RNA放于PCR仪中，95 ℃，5 min使其变性，之后立即置于冰上，备用。

3.4 磁珠预处理

3.4.1 取50 μL磁珠至离心管中，置于磁力架上，吸去上清。加入1 mL 20 mM的Tris-HCl（pH7.5），清洗磁珠后置于磁力架上，吸去上清，重复洗一次。

3.4.2 用800 μL 1×binding & washing buffer，洗3次，吸去上清；

3.5 RNA 与beads结合

3.5.1 向的beads中加入400 μL 2×binding & washing buffer；

3.5.2 向上一步中加入50 pmol已标记的RNA，再补380 μL DEPC水，使其终体积为800 μL；

3.5.3 室温慢速旋转30 min，使beads与RNA充分结合；

3.5.4 将上一步的管子置于磁力架上，吸去上清；

3.5.5 用800 μL 1×binding & washing buffer（含RNase Inhibitor, 1 U/ μL），洗3次，去除上清；

3.5.6 用cell lysis buffer A洗一次beads，吸去上清，注意不要让beads干掉。

3.6 RNA与蛋白相互作用检测

3.6.1 向上一步已处理好的beads中每管加入500 μL细胞裂解液；同时每管加入1 U/ μL浓度的RNase Inhibitor；

3.6.2 4 ℃慢速旋转2 h，使beads与细胞裂解液充分结合；

3.6.3 置于磁力架上吸去上清，用400 μL新鲜配制的cell lysis buffer A（+RNase Inhibitor+蛋白酶抑制剂），洗5次beads;

3.6.4 吸去上清，加入50 μL的Elution buffer，轻轻将磁珠吹匀，置于37 ℃孵育30 min，置于磁力架上，收集上清，做Western blot检测或者质谱检测。

4. 结果示例

该实验中，beads组作为阴性对照，AR 3'UTR RNA能够将HuR下拉，表明与HuR之间有相互作用。

 

参考文献

[1]. Bierhoff H. Analysis of lncRNA-Protein Interactions by RNA-Protein Pull-Down Assays and RNA Immunoprecipitation (RIP). Methods Mol Biol. 2018;1686:241-250.

[2]. Popova VV, Kurshakova MM, Kopytova DV. [Methods to study the RNA-protein interactions]. Mol Biol (Mosk). 2015 May-Jun;49(3):472-81. Russian.

[3]. Barnes C, Kanhere A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods Mol Biol. 2016;1480:99-113.

 

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