染色原理

革兰氏染色的原理是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上差别比较大，导致染色反应不一样，一般认为革兰氏阳性菌与碘和结晶紫的复合物结合比较牢固，不容易脱色，而阴性菌与碘和结晶紫的复合物结合程度较低，吸附染料的能力差，容易脱色，这是染色反应的主要依据。

染色步骤

实验步骤（石蜡切片）：

1. 组织包埋；
2. 切片制作，烤片；
3. 水化（脱蜡复水到纯水）；
4. 初染：滴加结晶紫染色液染色1-2min，使染色液进入细胞，清水冲洗去染色液；
5. 媒染：滴加Gram碘液，使之在细胞内与结晶紫形成复合物，并覆盖载玻片，室温放置1-2min，水洗；
6. 脱色：滴加脱色液，摇动10-30s，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，终止反应；
7. 复染：滴加复红复染液染色30-60s，水洗；
8. 干燥；
9. 镜检：置油镜观察、拍照。

染色结果

能抵抗脱色液脱色作用的细菌呈现紫色，因为红色虽被染上，但被紫色掩盖；如果未能抵抗酒精脱色，则呈现红色，即最后染色的结果为：深色（紫色）的为革兰氏阳性菌，红色的为革兰氏阴性菌。 

注意事项

01染色的条件

革兰氏阳性菌的菌体等电点较革兰氏阴性菌菌体的等电点低，在偏中性pH的条件下进行染色时，阳性菌吸附的碱性染料较多，不易脱去，阴性菌则相反，易脱去。若在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都比较多，都可呈现阳性反应；pH很低时，则可都呈现阴性反应。

01脱色的把控

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁等对结晶紫-碘复合物的通透性不一致，阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。

所以，在革兰氏染色实验操作中，染色条件、脱色时间、脱色方法都应严格控制，以保证结果的可靠性。