点突变是指基因序列中单个核苷酸碱基的改变。突变发生的位置对基因功能的影响大小不一。对非编码基因而言，大多数点突变没有什么影响；当突变位点位于基因启动子序列中时，则可能影响基因的表达；当发生在内含子剪接位点时，则可能会干扰RNA的正确剪接；当发生读码框内时，可能仅仅引起一个氨基酸的改变而改变整个蛋白的结构和功能。

        从进化论的角度看，点突变既可能是有益的也可能是有害的。有益的突变使个体产生优势，并将该特性传给后代，从而使整个种群得到改善；有害突变会导致个体死亡，或通过自然选择的方式使其繁殖能力大大降低从而被淘汰。而大多数情况下我们更关注因点突变引起的疾病，如遗传性疾病镰刀性贫血症以及各种肿瘤。

      通过构建点突变细胞株，可以进行单核苷酸多态性、遗传性疾病、肿瘤等的研究，也能用于靶向药、基因疗法的开发。基于大量项目的经验，睿远能够提供同源重组、单碱基编辑、先导编辑等多种技术，能够实现几乎所有位点基因突变细胞株的构建。

技术简介

同源重组技术

      利用CRISPR/cas9技术，设计并构建cas9/sgRNA和含目的基因点突变的供体载体（Donor），将CAS9/sgRNA和Donor质粒共转染目的细胞，通过sgRNA引导Cas9核酸酶对目的基因位点进行切割，引起DNA双链断裂（Double  strand  breaks    DSB)，细胞以Donor作为模板进行同源重组修复（HDR),将目标点突变重组到基因组靶位点，从而获得目的基因点突变的细胞系。

Base  editing  技术

        单碱基编辑技术是一种基于核酸酶失活的CAS9(dcas9）或cas9切口酶（cas9n）、胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1)或腺嘌呤脱氨酶（TadA)以及sgRNA形成的复合体，在不断裂DNA双链的情况下，利用sgRNA将复合体靶向与sgRNA互补配对的基因组靶位点，对靶向位点进行精准编辑，实现在活性窗口内C-T、G-A、A-G,T-C的单碱基转换

Prime   editing技术

    Prime  editing（PE)系统是在原有的CRISPR/CAS9体系基础上进行改造开发出来的基因编辑系统，该系统包括2个元件：pegRNA（prime  editing  guide  RNA）和nCas9(H840A)-M-MLV逆转录酶的融合蛋白。psgRNA是一段改造后的sgRNA，它在传统sgRNA的3‘末端增加了一段RNA序列。pegRNA由3个部分组成，包括Single-guide  RNA(sgRNA)、引物结合位点（Prime  Binding  site）PBS和储存有靶向位点编辑信息的逆转录模板（RT-template）。在pegRNA的引导下，融合蛋白会靶向sgRNA互补配对的基因组靶位点，并对含PAM的靶DNA链进行切割（pegRNA的非互补链）。随后，PBS序列与被切割的目标DNA链互补配对，逆转录产物（DNA）包含我们所需要的突变位点。这段逆转录DNA会入侵并进入基因组DNA发生整合，细胞利用体内修复机制对整合DNA切口进行修复，使所需要的突变位点整合到基因组靶位点，从而获得目的基因点突变的细胞系。

应用范围

方案选择

应用案例

细胞名称：Hep  G2

基因名称：CYP3A5

项目方案：根据CYP3A5基因突变位点序列设计sgRNA，利用CRISPR/CAS9对目的位点进行切割，引起DNA双链断裂，通过同源重组的方式将含有突变位点rs776746（A>G)的目的片段引入指定位点，通过GFP标签筛选出CYP3A5的单克隆细胞。

    阳性细胞鉴定：通过对流式分选筛选出的单克隆细胞进行PCR及测序鉴定，CYP3A5基因rs776746位点A成功突变为G

项目流程与周期

交付标准