石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒 产品货号：BA1793 产品规格：50T 产品简介： 从固定在福尔马林中提取和纯化出来的蛋白，可用于western blot，RPA，质谱，2D电泳分析。 产品组成： 试剂名称 50T 保存条件 蛋白提取缓冲液EXB 5mL -20℃ 二甲苯 5mL 室温 正庚烷 5mL 室温 β-巯基乙醇 300μL 室温 甲醇 30mL 室温 氯仿 5mL 室温 试剂盒成分保存： 提取缓冲液EXB应存放在-20°C。FFPE试剂盒中其它的组分应存放在室温干燥环境(15-25°C)。FFPE中的其它 成分正庚烷，甲醇，氯仿应储存在适当的储藏柜中，此条件下，该试剂盒至少可以稳定保存12个月。 载玻片上的石蜡组织切片脱蜡: 用户须自备的设备和试剂： 100%，96%，和70%(V/V)乙醇 石蜡包埋切片脱蜡罐 实验开始前注意事项: 二甲苯清洗(步骤1和2)应在通风橱内进行。 实验步骤： 1. 将载玻片转移到一个合适的装有二甲苯的容器中，玻片要被二甲苯完全覆盖，室温(15-25°)孵育10min。 2. 重复步骤1两次，每次使用新的二甲苯。 3. 将玻片放入100%乙醇中室温孵育10min，使用新的100%乙醇重复此步。 4. 将玻片转移到一个含有96%的乙醇的容器中孵育10min，使用新的96%乙醇重复这一步骤。 5. 将玻片转移到一个含有70%的乙醇的容器中孵育10min，使用新的70%乙醇重复这一步骤。 6. 浸在双蒸馏水中30s，用纸巾小心地擦去玻片上的水。 注意：纸巾不要触碰到组织，确保组织不要干。 7. 用针划下需要的组织转移到1.5mL离心管中。 8. 从FFPE组织切片中提取的总蛋白可进行western blot。 直接从一块石蜡包理样本中脱蜡: 用户须自备的设备和试剂： 微型离心机(适合于1.5mL离心管) 涡旋混合器 100%，96%，and70%(v/v)乙醇 实验开始前注意事项： 所有离心步骤都是在20-25°C使用台式进行离心(例如，Eppendorf® Micro Centrifuge 5417C or HeraeusBiofuge® 15 )。 二甲苯洗涤应在通风橱内进行。 实验步骤: 1. 从同一块组织中切3片10-15μm厚切片。 2. 立即把切片放在1.5毫升离心管中(提供)。 3. 向管子中加入1ml二甲苯，用力涡旋10s，孵育10min。 4. 将管子放入微型离心机中全速离心2min，小心弃掉上清。 5. 重复步骤3，4两次。 6. 加入1mL无水乙醇到包含有颗粒的管子中，涡旋混匀。孵育10min，全速离心2min。 7. 小心弃掉上清。 8. 不要搅乱管底颗粒 9. 重复步骤6，7。 10. 加1mL96%乙醇到管中，涡旋混匀。孵育10分钟，全速离心2min。 11. 小心弃掉上清。 12. 不要搅乱管底颗粒。 13. 重复步骤11，12。 14. 加1mL70%乙醇到管中，涡旋混匀。孵育10分钟，全速离心2min。 15. 小心弃掉上清。 16. 不要搅乱管底颗粒。 17. 重复步骤14，15。 注意：如有必要，重复离心的步骤，尽量去除乙醇残留。不要搅乱和弃掉管底颗粒。 18. 从FFPE组织切片中提取的总蛋白可进行进行westem blot。 从石蜡组织切片中提取的总蛋白用于western blot实验: 用户须自备的设备和试剂: 一次性手套 台式离心机或微型离心机（转速能达到14000×g） 涡旋混匀器 水浴或者金属浴锅（温度能够达到100℃） 热电搅拌器(Eppendorf，德国) 实验开始前注意事项 使用β-巯基乙醇应在通风橱中操作 实验开始前注意事项: 提供的提取缓冲液EXB未加β-巯基乙醇，每次提取过程中添加6μLβ-巯基乙醇到提取94μL的提取缓冲液EXB获得 工作液。 蛋白提取： 1. 取100μL提取缓冲液EXB(已加入β-巯基乙醇)加入到装有组织的1.5mL的离心管中，涡旋混匀，用密封夹封号 离心管。 2. 冰上孵育5min，涡旋混匀。 注意：确定离心管已经被密封好后在进行步骤3。 3. 将离心管放在水浴锅中100°C孵育20min。 4. 使用热电搅拌器，以750rpm速度，80℃，搅拌2h。 5. 然后将离心管放在4℃，1min，去掉密封夹。 6. 将离心管置于离心机中，4℃，14000×g，离心15min。 7. 转移含所提蛋白质的上清液到一个新的1.5毫升的离心管中(提供)。 从FFPE组织中提取蛋白—用于双向电泳或MS分析: 实验开始前注意事项: 提供的提取缓冲液EXB未加β-巯基乙醇。每次提取过程中添加6μLβ-巯基乙醇到提取94μL的提取缓冲液EXB获得 工作液。 流程: 脱蜡: 1. 从同一块组织中切3块10-15μm厚切片。 注意：如果你不确定你的样品中含有多少蛋白质，我们建议使用2个切片，每一个厚度为10μm，面积100平方毫 米制备。 2. 把切片在1.5毫升离心管中(提供)。 3. 吸取0.5mL的庚烷到管子中，盖紧管子用力涡旋10s，室温孵育1h(15-25℃)。 4. 加25μL甲醇，扣紧管子，大力涡旋10s。 5. 9000×g离心2分钟。 管底会出现沉淀 6. 小心弃掉上清，在空气中干燥5min。 蛋白提取 7. 取100μL提取缓冲液EXB(已加入β-巯基乙醇)加入到装有组织的1.5mL的离心管中，涡旋混匀，用密封夹封号 离心管。 8. 冰浴5min，然后涡旋混匀。 确保离心管密封好再进行步骤9。 9. 将离心管在100℃水浴锅中孵育20min。 10. 使用热电搅拌器，以750rpm速度，80℃，搅拌2h。 11. 然后将离心管放在4℃，1min，去掉密封夹。 在进行12步之前确定密封夹已经被去除。 12. 将离心管置于离心机中，4℃，14000×g，离心15min。转移含所提蛋白质的上清液到一个新的1.5mL的离心 管中(提供)。 双向电泳蛋白样品制备: 13. 加400μL甲醇到100μL步骤12所得的蛋白溶液中，扣紧盖子，大力涡旋10s。 14. 9000×g离心10s。 15. 加100μL氯仿，扣紧管子，大力涡旋10s。 16. 9000×g离心10s。 17. 加300μL水，扣紧管子，用力涡旋10s。 18. 9000×g离心1min。 注意：离心后，样品分为3层：最低层，无色，有机相(氯仿)；中间层含蛋白质；上部，无色，水相。 19. 小心弃掉上层水相。 不要搅乱中间层和底层。 20. 加300μL甲醇，扣紧盖子，大力涡旋。 21. 9000×g离心2min。 22. 小心弃掉上清。 注意：该蛋白是位于管子底部的可见的透明或白色凝胶状沉淀。 23. 加入1mL乙醇到离心管中洗涤沉淀，而后900×g离心2min，小心弃掉上清。 注意：不要使沉淀干燥 24. 加入适量体积的缓冲液溶解蛋白沉淀用于双向电泳。 根据凝胶尺寸和染色方法，双向电泳分析所需的蛋白质量从50-250μg。