干货分享 | 常用PCR技术及原理 你会做吗?
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- 2023-09-23 11:53:53
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- PCRPCR检测分子实验荧光定量PCR
1、PCR
PCR即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、扩增增强因子，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
2、热启动PCR
常规PCR的扩增开始时间并不是放进PCR仪，运转程序才开始扩增。当体系配置完成的时候，扩增就开始了，这可能会引起非特异性扩增出现，热启动PCR可以解决这一问题。什么是热启动PCR？当反应体系配制好后，在反应初始加热阶段或“热启动”阶段，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活。具体激活时间和温度取决于DNA聚合酶以及热启动修饰物的性质。该方法主要利用抗体、亲合配体、或化学修饰物等修饰物，来抑制的DNA聚合酶的活性。由于DNA聚合酶在常温下的活性被抑制，热启动技术为在常温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，且无需牺牲PCR反应的特异性。
3、逆转录PCR
逆转录PCR，是从mRNA逆转录成cDNA并以此为模板进行扩增的一种实验技术。实验流程是先提取组织或细胞中的总RNA，以Oligo（dT）为引物，利用逆转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
注：oligo(dT)是由数量少于20的脱氧胸苷酸连接而成的核苷酸链，它可以特异性地结合到mRNA的poly(A)尾端(多A尾)，从而使逆转录酶只能逆转录含有poly(A)尾的mRNA。
4、荧光定量PCR
荧光定量PCR（RT-qPCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。常用的qPCR方法有荧光染料法（SYBR Green I）和探针法（TaqMan）。染料法（常用SYBR Green Ⅰ）：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。探针法（常用TaqMan探针）：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
5、数字PCR
数字PCR（dPCR）是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数；数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。除了基因表达和拷贝数检测，数字PCR也适用于诸如低频等位基因的辨别、病毒滴定和二代测序文库的绝对定量。
