Flag-Nanoab-Agarose 抗体 

货号：FNA-25-500， FNA-50-1000

保存条件：4℃一年；-80℃长期保存，避免反复冻融。存储缓冲液，PBS(含有 20%乙醇)。 

产品描述
偶联 anti-Flag-tag 纳米抗体的琼脂糖珠子用于免疫沉淀 Flag-tag (DYKDDDDK)融合蛋白。

产品优势
没有普通抗体的轻链和重链；
即用型，节约时间；
高亲和力，高载量;

应用范围
可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性测定、质谱分析等；

特异性
特异性结合 Flag-tag。

实验步骤：

收集细胞
每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 个表达 Flag-tag 融合蛋白的细胞，可根据 Flag-tag 融合蛋白表达量适当调整细胞数。
吸出培养基，向培养皿中加入预冷的 1×PBS，漂洗 2 次，利用细胞刮或胰酶消化收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500g 离心 3min 并丢弃上清液。

细胞裂解
1.在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，用 500μl 预冷的裂解缓冲液重悬细胞。
2.置于冰上 30 分钟，可每 10 分钟充分吹打一次。
3．4℃，20,000g 离心 15 分钟，将裂解产物（上清）转移到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。注意：此时细胞裂解产物可长期保存于-80℃。

平衡珠子
4.充分混匀 Flag-Nanoab-Agarose，吸取 20μl 该产品到 500 μl 预冷的裂解缓冲液中，4℃，2,500g 离心 30 秒，丢弃上清液。（此步骤可选）

结合蛋白
5.将平衡好的 Flag-Nanoab-Agarose 加入到细胞裂解产物中（如果未做第 4 步，可在细胞裂解产物中直接加入 20μl 该产品），于 4℃旋转混合结合 1 小时。根据实验需要可调整结合时间。如果需要，留存 50μl 的裂解产物进行免疫印迹分析。
6．4℃，2,500g 离心 30 秒，丢弃上清液。如果需要，留存 50μl 上清液进行免疫印迹分析。

清洗珠子
7.用 500μl 预冷的裂解缓冲液中重悬 6 中的 Flag-Nanoab-Agarose，4℃，2,500g 条件下离心 30 秒，丢弃上清液并重复洗涤 3 次。尽量减少清洗时间。

洗脱蛋白
方法一：
8.加入 20μl 2×SDS-sample buffer 重悬 Flag-Nanoab-Agarose。95℃，加热 10min 充分变性，2,500g 离心 30 秒收集上清，收集的产物可进行 SDS-PAGE 及免疫印迹分析。

方法二：
9.替代步骤 8 的可选步骤：加入 50μl 0.2M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白，孵育时间 30 秒，期间不断混匀，2,500g 离心 30 秒收集上清， 立即加入 5μl 1.0M Tris（pH10.4）以中和酸性的甘氨酸。
注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。
如果洗脱的蛋白含量少，可尝试用 2×Flag-tag 进行亲和纯化。

可选方案
方案一：
如需进行 Flag 融合酶的活性检测，无需洗脱，可以直接检测。

方案二：
如需进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，主要用于含有 Flag 融合蛋白的蛋白质/DNA 相互作用的实验。染色质免疫沉淀一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，联反应的逆转，DNA 的纯化以及 DNA 的鉴定。其中前期细胞固定，染色质断裂不变；然后接着直接进入说明书的第 5 步，加入细胞裂解产物后，DNA-蛋白质复合物结合到 Flag-Nanoab-Agarose 上；
进入第 6 和 7 步，分离得到复合物；进入第 9 步，得到洗脱的复合物；后期交联反应的逆转，DNA 的纯化及 DNA 的鉴定等同于普通的 ChIP 实验。RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验步骤同上。

方案三：
Flag-Nanoab-Agarose 不仅可以用于在体内外检测和验证蛋白质之间的相互作用，也可以结合质谱分析筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步骤同免疫沉淀法，得到洗脱的复合物后，然后进行 SDS–PAGE 分析，用考马斯亮蓝或者银染的方法染色后，切下未知蛋白的条带，用质谱技术鉴定未知蛋白。