质粒是分子生物学研究中最常用的科研工具之一。质粒构建是指利用内切酶和连接酶将目的基因DNA序列克隆到不同的质粒载体中。质粒转导进入目标细胞，从而实现外源基因过表达，广泛应用于生物医学领域基因功能和机制的基础研究中，例如mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA和shRNA的过表达，病毒制备、以及稳转株构建和基因编辑等。

1. 实验原理

骨架载体和目标基因双链DNA在限制性核酸内切酶作用下，形成粘性末端或平末端，并进行纯化；酶切纯化后的线性质粒和目标DNA在DNA连接酶的作用下，进行连接；连接后进行进行大肠杆菌感受态细胞转化并涂板（抗性筛选）生长；最后挑取单克隆进行测序验证，确认载体构建成功。根据启动子载体的不同，可将质粒分为真核表达质粒和原核表达质粒2大类。在真核表达质粒中，启动目标基因的启动子也是多种多样，在实际应该用中需根据待克隆目标基因的特性选择合适高效的携带特异启动质粒。

2. 实验步骤

2.1 引物设计

结合载体和目标基因序列信息，设计PCR引物，且添加合适的限制性内切酶序列以及保护碱基，为下游酶切链接奠定基础。

2.2 骨架质粒制备

目标质粒转化TOP10感受态质粒，并涂板生长。16h后挑取单克隆进行扩大培养。利用OMEGA质粒DNA抽提试剂盒抽提质粒DNA，并测定浓度和电泳确定质粒DNA质量。

2.3 克隆DNA制备

待克隆双链DNA可以通过PCR法扩增获取，亦可利用基因合成的办法制备。同样获得后测定浓度并电泳质控。

2.4 酶切纯化

目标质粒和目标DNA分别利用限制性酶切酶进行酶切，并且琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目标片段，纯化后进行浓度测定和电泳质控。

2.5 酶连

线性载体和目标DNA按照合适的摩尔比进行混合，并加入DNA连接酶和缓冲体系，进行链接。

2.6 转化和测序鉴定

连接液灭活后，进行质粒转化（TOP10或DH5ɑ），16h后挑取单克隆进行扩大摇菌，并测序验证克隆成功。

参考文献

[1] Green, Michael R.; Sambrook, Joseph (2020). Cloning in Plasmid Vectors: Directional Cloning. Cold Spring Harbor Protocols, 2020(11).

[2] Bierman, M; Logan, R; O'Brien, K; Seno, ET, et al (1992). Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.. Gene, 116(1), 43–49.