CD20（Cluster of Differentiation 20）是MS4A家族的一员，由297个氨基酸组成的磷蛋白，具有4个跨膜结构域，在B细胞发育中起关键作用。在血液、扁桃体、阑尾、淋巴结和脾脏等多组织表达，正常脑组织和一些免疫细胞上检测不到表达。CD20敲除小鼠与同窝野生型小鼠一样茁壮成长和繁殖，在其出生后第一年未出现任何明显的解剖或形态学异常，或对感染的易感性。

CD20没有已知的天然配体，其功能是实现最佳的B细胞免疫应答，特别是针对T细胞非依赖性抗原。CD20表达密度存在B细胞亚群特异性差异，在B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和黑色素瘤癌干细胞高表达。尽管CD20的功能尚不完全清楚，但它具有动态的细胞活性，是B细胞恶性肿瘤的理想特异性治疗靶标。

CD20抗体的6种作用机制^[1]

 

CD20抗体

CD20抗体是迄今为止最成功的抗肿瘤治疗方案之一，各大药企进行了各种基因工程研究和人源化改造，试图设计和生成强大的CD20抗体。CD20抗体生产的初步成功，推进了单克隆抗体设计方法不断改进。其中4种类型的CD20抗体，包括利妥昔单抗、Ofatumumab、Obinutuzumab和Ublituximab分别于1997年、2010年和2014年在美国和欧洲获批用于治疗慢性淋巴细胞白血病。

CD20单克隆抗体设计的不断改进^[2]

 

CD20单克隆抗体批准上市时间表及对应症^[3]

目前，抗 CD20 单抗已经发展到第三代，每一代抗体药物均有各自特有的临床应用价值。

 

01、第一代CD20单克隆抗体

第一代CD20抗体以利妥昔为代表，针对B细胞上CD20抗原的利妥昔单抗是一种基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体，是全球第一款CD20单克隆抗体(mAb)上市药物，上市后迅速成为治疗某些B细胞恶性肿瘤特定类型的标准方案，延续至今。

美罗华^@利妥昔单抗注射液

第一代CD20单抗的疗效很好，甚至对于一直以来的治疗方案产生革命性的影响，但由于其是嵌合鼠/人单克隆抗体，因此使用时会存在一定的排异反应，产生负作用影响治疗效果。为提升治疗效果降低副作用，CD20单抗的药物制备技术不断更新换代，衍生出了第二代CD20单抗。

 

02、第二代CD20单克隆抗体

第二代抗CD20 mAb将CD20人源化或者全人源改造，降低免疫原性，包括Ofatumumab、Veltuzumab和Ocrelizumab。Ofatumumab (OFA)是一种全人源 I 型抗CD20 IgG1k mAb。Ofatumumab与CD20分子的小和大胞外环(ECL)均结合，在杀伤靶细胞方面比利妥昔单抗更有效。OFA(arzerra)已获批用于治疗氣达拉滨和阿仑单抗治疗失败的复发性或难治性CLL(FA-ref)，目前正在开发OFA联合其他药物治疗各种B细胞肿瘤。

第二代CD20单克隆抗体^[4]

 

与一代CD20抗体相比二代CD20抗体免疫原性降低，减少不良反应，但是二代CD20抗体特异性和抗原结合的亲和力有所下降，因此第三代产品应运而生。

 

03、第三代CD20单克隆抗体

第三代人源化CD 20 mAb具有Fc工程化改造，以增加其与FcyRIIIa受体的结合亲和力，包括 Ocaratuzumab、PR0131921和Obinutuzumab，均在进行不同适应症的临床开发。Ocaratuzumab（AME-133v）是一种 I 型人源化IgG1 mAb。其与CD20的结合亲和力增加13-20倍，与FcyRIIIa受体低亲和力(F/F和F/V)变体的亲和力增加5-7倍。这些可能是克服利妥昔单抗缓解率较低和缓解持续时间较短的机制。Obinutuzumab（GA101）在2013 年已获得美国 FDA 批准上市，主要适用于未经治疗的慢性淋巴细胞白血病患者以及联合苯达莫司汀二线治疗复发性滤泡性淋巴瘤。

第三代CD20单抗^[4]

 

虽然CD20单抗的药物制备技术经过多次更新换代，二代三代各具优势，但与一代产品利妥昔单抗相比，在适应症和疗效上并未更具优势，因此目前市场上第一代产品利妥昔单抗依然占据绝对地位。

 

发展前景

CD20 单抗是世界上第一个上市的单克隆抗体，具有多年的临床治疗数据，对应不同的适应症以及设计优化，该靶点尚具有巨大的市场潜力。此外基于CD20靶点的研究的人源化单克隆抗体、双特异性抗体、CAR-T疗法、抗体偶联药物（ADC）、与小分子药物联合治疗等研究，均取得良好的效果。

国内外有多家企业展开针对CD20靶点的单抗，双抗以及联用药物的研究，超110多个研究管线处于临床前期或已进入临床阶段，超23款药物已上市。今年9月，北京神州细胞自主研发的新型抗CD20单抗——“安平希”瑞帕妥单抗获批上市，是国产首款抗CD20单抗上市药物。

 

国内外部分CD20药物临床研发进展

数据来源：Cortellis

通过众多临床试验及以往多年研究积累，证实了 CD20 靶点是治疗 B 细胞淋巴瘤的重要靶点，以CD20 为靶点研发出的药物在临床治疗 B 细胞淋巴瘤中发挥了关键作用。百奥动物自主研发的CD20系列人源化小鼠及细胞系，是靶向CD20抗体开发相关药物进行药效评价的优质模型。

 

B-hCD20 mice

01、基本信息

 

02、mRNA表达分析

RT-PCR分析CD20基因在野生型小鼠和B-hCD20小鼠中的表达情况。

鼠CD20 mRNA仅在野生型(+/+)小鼠脾细胞中可检测到。人CD20 mRNA仅在纯合子B-hCD20(H/H)小鼠中检测到，而在野生型(+/+)小鼠中检测不到。

 

03、蛋白表达分析

用流式细胞术分析B-hCD20纯合子小鼠CD20的蛋白表达。

采集野生型C57BL/6小鼠和纯合子B-hCD20(H/H)小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD20抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠CD20仅在野生型C57BL/6(+/+)小鼠中检测到；人CD20仅在纯合子B-hCD20(H/H)小鼠中检测到，在C57BL/6(+/+)小鼠中检测不到。

 

B-hCD28/hCD20 mice

01、基本信息

 

02、蛋白表达分析

流式细胞术分析B-hCD28/hCD20纯合子小鼠CD28的蛋白表达。

采集野生型C57BL/6(+/+)小鼠和纯合子B-hCD28/hCD20(H/H;H/H)小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD28抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠CD28仅在C57BL/6(+/+)小鼠中检测到；人CD28仅在纯合子B-hCD28/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到，在C57BL/6(+/+)小鼠中检测不到。

流式细胞术分析B-hCD28/hCD20纯合子小鼠CD20特异性表达。

采集野生型C57BL/6(+/+)小鼠和纯合B-hCD28/hCD20 (H/H;H/H)小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD20抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠CD20仅在C57BL/6(+/+)小鼠中检测到；人CD20仅在纯合子B-hCD28/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到，在C57BL/6(+/+)小鼠中检测不到。

 

B-hCD3E/hCD20 mice

01、基本信息

 

02、蛋白表达分析

流式细胞术分析B-hCD3E/hCD20纯合子小鼠CD3E的蛋白表达。

采集野生型C57BL/6(+/+)小鼠和纯合子B-hCD3E/hCD20(H/H;H/H)小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD3E抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠CD3E仅在C57BL/6(+/+)小鼠中检测到；人CD3E仅在纯合子B-hCD3E/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到，在C57BL/6(+/+)小鼠中检测不到。

流式细胞术分析B-hCD3E/hCD20纯合子小鼠CD20的蛋白表达。

采集野生型C57BL/6(+/+)小鼠和纯合子B-hCD3E/hCD20(H/H;H/H)小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD20抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠CD20仅在C57BL/6(+/+)小鼠中检测到；人CD20仅在纯合子B-hCD3E/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到，而在C57BL/6(+/+)小鼠中检测不到。

 

03、免疫分型

脾脏白细胞亚群的流式分析。

分离野生C57BL/6(+/+)小鼠和B-hCD3E/hCD20 (H/H;H/H)小鼠（雌性，n=3，6周龄）的脾细胞并进行白细胞亚群流式分析。A.代表性单活CD45+细胞的流式分析。B.图A的统计学分析。结果显示：纯合子B-hCD3E/hCD20小鼠的T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的比例与C57BL/6小鼠相似，证明人源化CD3E/CD20不影响脾脏中这些细胞集群总体的发育、分化或分布。数值：平均值 ± SEM

脾脏T细胞亚群的流式分析。

分离野生型C57BL/6(+/+)小鼠和B-hCD3E/hCD20 (H/H;H/H)小鼠(雌性，n=3，6周龄)的脾细胞并进行T细胞亚群流式分析。A.代表性CD3+ T细胞的流式图分析。B. 图A的统计学分析。结果显示：纯合子B-hCD3E/hCD20小鼠的CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和Treg细胞的比例与C57BL/6小鼠相似，证明人源化CD3E/CD20不影响脾脏中这些T细胞集群总体的发育、分化和分布。数值：平均值 ± SEM

人源化CD3E/CD20同样也不影响淋巴结、血液中白细胞亚群和T细胞亚群总体的发育、分化和分布。（数据未展示）

 

B-hCD3EDG/hCD20 mice

01、基本信息

 

02、mRNA表达分析

RT-PCR分析CD3DG基因在野生型小鼠和B-hCD3EDG/hCD20小鼠中的表达。

小鼠Cd3d和Cd3g mRNA仅在野生型(+/+)小鼠胸腺细胞中检测到。人CD3D和CD3G mRNA仅在纯合B-hCD3EDG/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到，而在野生型(+/+)小鼠中检测不到。

 

03、蛋白表达分析

流式细胞术分析纯合B-hCD3EDG/hCD20小鼠中CD3E的蛋白表达。

采集野生型C57BL/6 (+/+)小鼠和纯合子B-hCD3EDG/hCD20(H/H;H/H)小鼠脾细胞，用种属特异性抗CD3E抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠CD3E仅在C57BL/6 (+/+)小鼠中检测到；人CD3E仅在纯合子B-hCD3EDG/hCD20 (H/H;H/H)小鼠中检测到，而在C57BL/6 (+/+)小鼠中检测不到。

流式细胞术分析B-hCD3EDG/hCD20纯合子小鼠中CD20的蛋白表达。

采集野生型C57BL/6 (+/+)小鼠和纯合子B-hCD3EDG/hCD20 (H/H;H/H)小鼠脾细胞，采用种属特异性抗CD20抗体进行流式细胞术分析。结果显示：鼠CD20仅在C57BL/6 (+/+)小鼠中可检测到；人CD20仅在纯合子B-hCD3EDG/hCD20(H/H;H/H)小鼠中检测到，而在C57BL/6 (+/+)小鼠中检测不到。

CD20靶点相关模型列表

参考文献:

1. Payandeh, Z. et al. The applications of anti-CD20 antibodies to treat various B cells disorders. Biomed Pharmacother 109, 2415-2426 (2019).

2. Lim, S.H. et al. Anti-CD20 monoclonal antibodies: historical and future perspectives. Haematologica 95, 135-143 (2010).

3. Marshall, M.J.E., Stopforth, R.J. & Cragg, M.S. Therapeutic Antibodies: What Have We Learnt from Targeting CD20 and Where Are We Going? Front Immunol 8, 1245 (2017).

4. Shundong Cangl, N.M., Kemeng Wang2 and Delong Liu2. Novel CD20 monoclonal antibodies for lymphoma therapy. Cang et al. Journal of Hematology & Oncology 5 (2012).