Acme-packaging病毒包装试剂盒

 

Cat. No. GE-19001-20/50

 

 

用户手册

 

Version 1.1

 

This product is for research use only and is not intended for diagnostic use.

 

产品内容

 

试剂名称	内容	规格	储存 条件
		-20T	-50T
Solution 1	2.5M CaCl2	1.5ml	3ml	-20oC
Solution 2	2× BBS	10ml	25ml
Solution 3	Modified Fetal bovine serum	10ml	25ml
Solution 4	Packaging Enhancer (1000×)	400μl	1ml
Solution 5	Infection Enhancer (1000×)	100μl	250μl
Control plasmid	CMV-EGFP	20μg	40μg

 

注：（Solution 1、Solution 2应避免反复冻融，请根据实验情况分装使用。）

 

其他所需材料

超纯水

293T (Acme-293T，东岭生物)

DMEM高糖培养基

Fetal bovine serum (FBSV500，东岭生物)

磷酸盐缓冲液 (PBS: 137 mM NaCl, 2.6 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, Adjust the pH to 7.4 with HCl)

 

 

简介

在包装重组病毒的过程中，质粒转染是影响病毒包装效果的重要一步。本试剂盒是基于CaPO₄法开发的病毒包装试剂盒，

在293T细胞中有非常好的转染效果。

CaPO₄法最初是作为检测病毒DNA传染性的一种技术而发展起来的，由CaPO₄形成的沉淀通过增强DNA对细胞膜的

吸附作用，促进哺乳动物细胞对DNA的摄取，从而达到转染的目的。CaPO₄沉淀还限制了哺乳动物

细胞内DNA酶对DNA的消化。

本试剂盒包含能够快速、简便、高效地对293T细胞进行质粒转染的必要试剂，可同时用于慢病毒和逆转录病毒的包装，

可在100mm培养皿中进行20-50次转染。Solution 1和Solution 2用于形成CaPO₄沉淀；Solution 3为本公司生产并经

严格筛选的胎牛血清，用于病毒包装过程中添加到细胞培养基中；Solution 4为病毒包装增强试剂，可有效提过病毒包装效率；

Solution 5为病毒感染增强试剂，用于靶细胞感染；Control plasmid为EGFP慢病毒质粒，用于包装阳性对照病毒。

 

操作流程

 

操作步骤

注：请在实验开始前认真阅读完整实验步骤

本说明概述了使用100mm细胞培养皿进行瞬时转染包装慢病毒所需的步骤，逆转录病毒包装体系及条件略有不同。

如果使用其他规格培养皿，请根据培养皿底面积按比例调整相关试剂用量(参考附录)。质粒用量及比例可根据推荐用量做优化。

病毒包装对细胞状态有较高要求，推荐使用传代次数较低、扩增倍数稳定、形态正常的细胞用于包装。

 

病毒包装

提前一天消化293T细胞，重悬于37℃预热的DMEM完全培养基中（10% FBS，无抗生素，以下简称为D10），计数；

每个培养皿接种4.5×10^6细胞，10ml D10，轻轻晃动，将细胞完全混匀；

在含5% CO₂ 培养箱中37℃培养过夜（转染前细胞密度应达到60%-70%，可根据细胞生长速度对细胞接种量作调整）；

转染前3h配制含有2.5% Solution 3的DMEM培养基（以下简称为D2.5，不含双抗），37℃预热备用；

转染前2h吸去培养皿中培养基，每皿更换7ml上一步预热的D2.5，放入培养箱中备用，注意避免细胞脱落；

准备涡旋仪，70%酒精擦拭消毒后置于无菌操作台备用；

根据下表准备DNA混合液（该体系以慢病毒包装载体pMD2G和psPAX为例，为1个100mm培养皿用量）：

 

试剂	用量
pMD2G	6μg
PSPAX	15μg
慢病毒表达载体	20μg
H2O	Add H2O to 450μl

 

边涡旋边逐滴加入50μl Solution 1，以充分混匀；

注：以上所用试剂均需恢复至室温，阳性对照组用CMV-EGFP代替慢病毒表达载体。

 

在15ml离心管中准备等体积500μl Solution 2，在涡旋仪上快速涡旋，

同时逐滴加入配制好的DNA混合液（该过程必须逐滴加入）；滴加结束后再涡旋5-10s；

注：因Solution 2 pH对温度非常敏感，必须恢复至室温后使用。

将混合液室温孵育20min；

同时，在待转染细胞培养皿中加入8μl Solution 4，混匀后放于培养箱备用；

孵育结束后用移液枪或移液管轻轻混匀混合液，此时可见混合液略有浑浊；

注：混匀一定要轻柔，可通过吹泡泡 (bubble mix）的方式混匀。

将混合液逐滴均匀滴加至培养皿中，前后左右轻轻晃动培养皿，充分混匀；

将培养皿放于含3% CO₂ 培养箱中培养；

12-16h之后（不超过16h），37℃预热DMEM无血清培养基（可用PBS代替）和D2.5；

吸去培养皿中培养基，用预热的DMEM无血清培养基轻轻洗2次，10ml/次，

之后加入10ml 上步预热的D2.5，混匀后置于含5% CO₂ 培养箱中37℃培养；

转染36-48h后收集培养上清，2200rpm，4℃离心10min去除细胞碎片，

置于4℃冰箱短期保存（不超过2天），或分装后于-80℃长期保存。

注：冻存的病毒应在冰上或4℃解冻，且避免反复冻融。

收集的病毒上清可直接用于滴度测定，或浓缩后分装保存；

本公司同时提供病毒浓缩试剂（货号：GE-19002-50），可方便快捷高效地浓缩病毒，不需要超速离心机。

 

 

滴度测定（流式法）

注：该方法适用于含有EGFP等荧光蛋白标记的病毒载体，或可通过流式检测目的蛋白的病毒载体的滴度测定；

本公司也提供慢病毒滴度检测试剂盒（货号：GE-20006-100），可通过Real-time PCR检测病毒滴度，适用于全部慢病毒。

 

提前一天接种293T细胞于96孔板，每孔1×10^4细胞，100μl；培养过夜；

注：每种病毒准备6个孔，另需额外准备10个孔用于细胞计数。

准备含有1× Solution 5的DMEM完全培养基（10%FBS），37℃预热；

消化10孔细胞，计数，算出每孔细胞数N；

根据右图逐级稀释病毒，并在对应细胞中加入10μl稀释好的病毒；

注：浓缩的病毒可稀释10倍后再逐级稀释。

每孔加入100μl准备好的DMEM完全培养基，2000rpm，30℃离心1h；

离心结束后将细胞放回培养箱中培养；

72h后，收集细胞，流式测定阳性细胞百分比TM%，选择15-25%之间的TM%用于滴度计算；

根据以下公式计算病毒滴度：

Virus titer, TU/ml

DF：病毒稀释倍数；

V：每孔加入病毒体积，0.01ml；

 

 

常见问题

 

常见问题	建议
转染孵育后沉淀不可见或太细	加入了太多的DNA。检查DNA的OD260并适当 调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA 转染以确定最佳浓度。
转染孵育后沉淀物密度太大， 有聚集的团块	加入的DNA太少。检查DNA的OD260并适当 调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。
无法从培养皿中洗去沉淀物	确保PBS不含Ca2+或Mg2+，洗液只含有配方 中所列成分的阳离子。
转染效率高，但病毒滴度低	优化病毒表达质粒和包装质粒的比例和用量， 理论上表达质粒越大，包装所需用量越多。

 

 

附录

不同规格培养皿底包装体系参考:

 

	6孔板	10cm 培养皿	15cm 培养皿
底面积	cm2	Cm2	Cm2
底面积比	1	5.7	15.8
转染前换液体积	1.226 ml	7 ml	17.5 ml
DNA-CaPO4 mixture体积	0.174 ml	1 ml	1.5 ml
培养体积	2 ml	10 ml	25 ml
洗涤体积	2 ml	10 ml	25 ml