YF®488TUNEL 细胞凋亡试剂盒

 

产品货号：B0013

存储条件：本产品应置于-20℃储存，组分 B 需避光，避免反复冻融。

注：组分 A 和 B 使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤，请立即用大量水冲洗。

产品组分

组分	20T	50T
A. TUNEL Equilibration Buffer	2×1 mL	5 mL
B. YF®488 TUNEL Reaction Buffer	1 mL	2 × 1.25 mL
C. TdT Enzyme	20 μL	50 μL
D. Proteinase K (2 mg/mL)	40 μL	10 0 μL
E. DNase I (2 U/μL)	5 μL	13 μL
F. 10 × DNase I Buffer	10 0 μL	26 0 μL

 

产品介绍

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解， 这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段为180 bp-200 bp的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状Ladder图谱。本试剂盒采用 TUNEL 法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡细胞中断裂DNA的3´-OH末端催化掺入 YF®/Cy-dUTP，YF®/Cy-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。标记的dUTP（如地高辛-dUTP、生物素-dUTP），可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。

使用方法

实验材料（自备）

PBS 缓冲液（pH~7.4）

4%多聚甲醛（PBS 配制）

牛血清白蛋白（BSA）或正常的羊、牛血清

70%乙醇（自选）

脱蜡溶剂（石蜡切片样本）

 

实验步骤

1.样本准备：

（1）细胞样品

a.可选：准备一份阴性对照样本（加入不含TdT酶的TUNEL 反应液）。

b.PBS 清洗细胞两次。

c.细胞固定：加适量 4%多聚甲醛（pH 7.4），4℃放置 30 min

d.PBS 清洗细胞两次。

e.通透细胞：细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100溶液通透，室温放置 20 min。

f.PBS 清洗细胞两次。

（2）石蜡组织切片

a.室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次，每次 5 min，以彻底脱掉石蜡。

注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。

b.室温下，将样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次，每次 5 min。

c.室温下，将切片样本连续依次浸没在不同浓度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗 1 次， 每次5 min。

d.室温下，将切片浸没于纯水中漂洗 3 min，再将切片浸没于1×PBS 中漂洗3 min，用滤纸小心吸干切片样本周围液体。

e.用免疫组化笔描绘样本轮廓，以便下游通透与标记。

f.按 1: 100 的比例，将 2 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液用 1× PBS 稀释至终浓度 20 µg/mL，在每个样本上滴加 100 µL，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育 20 min。（蛋白酶 K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，时间短达不到通透效果， 但延长孵育时间可能导致切片脱落。一般情况下，厚度 4 µm孵育 10 min，厚度 30 µm 孵育 30 min。

g.PBS 浸润清洗切片 2 次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

注：这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

（3）冰冻组织切片

a.将冰冻切片放置于室温的片架上，室温 20 min，晾干。

b.将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液中，室温固定 30 min。

c.PBS 浸润清洗切片 2 次，每次 5 min。

d.用滤纸小心吸干切片样本周围液体。

e.按 1: 100 的比例，将 2 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液用 1× PBS 稀释至终浓度 20 µg/mL，在每个样本上滴加 100 µL，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育 20 min。（蛋白酶 K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，时间短达不到通透效果， 但延长孵育时间可能导致切片脱落。一般情况下，厚度 4 µm孵育 10 min，厚度 30 µm 孵育 30 min。

f.PBS 浸润清洗切片 2 次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

（4）阳性处理（仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行 TUNEL 反应步骤）

a.按 1: 10 的比例用ddH2O 将 10× DNase I Buffer 稀释成 1×DNase I Buffer 备用。

b.滴加 100 µL 1× DNase I Buffer 到已通透的样本上，覆盖全部样本区域，室温平衡 5 min。

c.用 1× DNase I Buffer 以 1: 100 稀释 DNase I (2 U/μL)至终浓度 20 U/mL 的工作液。

d.轻轻吸掉多余液体， 加入 100 μL 浓度为 20 U/mL 的DNase I 工作液，室温孵育 10 min。

e.轻轻吸掉多余液体，PBS 清洗样品 2 次。

2.TUNEL 反应

（1）每个样本加入 100 μL TUNEL Equilibration Buffer，室温孵育 5 min。

（2） 预先配制 TUNEL 反应混合液： 每 50 μL TUNEL Reaction Buffer 中加入 1 μL TdT 酶。

（3）弃去 TUNEL Equilibration Buffer，每个样本加入 50 μLTUNEL 反应混合液。

a.贴壁细胞，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育 60 min。

b.悬浮细胞，可加入微孔板中，采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管，使之充分反应。37℃ 避光孵育 60 min。

c.组织样本，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育 2 h（湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度）。

（4）去掉反应液，在 1× PBS 的染色缸中浸泡润洗 2 次，每次 5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100， 其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本 3 次，每次 5 min， 以降低背景。

（5）（可选）复染：每个样本滴加浓度为 2 μg/mL 的 DAPI染液，室温避光孵育 10 min。染色完成后，去掉染液，并将样本在 1× PBS 中浸泡润洗 3 次，每次 5 min。

（6）（可选）石蜡切片封片：将切片依次在纯水、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇中浸没 5 min， 最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡，透明化处理 2 次，每次 5 min。脱水完成后，擦去切片周围的液体， 每个样本滴加 50 μL 抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。

7) 用荧光显微镜或流式细胞仪观察。（凋亡细胞应被标记上明亮的荧光，没有加入 TdT 酶的阴性对照样本不能被标记上荧光）。

注意事项

1.荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。