细胞冻存步骤的专业实验流程

在细胞培养 检测实验在实验仪器、培养基等等工作上都要耗费不少的人力和体力。好在很久以前就有高人发明了细胞保存这个实验步骤，将暂时多出来的细胞冰冻保存，以最大程度保存细胞活力。

一、细胞冷冻保存

1. 材料：

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO (Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene　5000-0020)、0. 4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)

2. 冷冻保存方法：

(1)传统方法: 冷存管置于4 ℃10分钟--->-20 ℃30分钟--->-80 ℃ 16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。

-20 ℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 ℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3 ℃/分钟之速度由室温降至(-80 ℃以下)-120 ℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

3. 步骤：

(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。

(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜 (DMSO)至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。

(3)离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0. 1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

(4)取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5～10%)，使细胞浓度为1～5×106cells/ ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。

4. 注意事项：

(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。

(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0. 22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10 ml小体积分装，4 ℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。

(4)冷冻保存之细胞浓度：

①normal human fibroblast:1～3×106cells/ ml

②hybridoma:1～3×106cells/ ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ ml

④other suspensions:5～10×106cells/ ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ ml。

(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

(6)冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时)，复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。

二、冷冻细胞活化

1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。

3. 材料

37 ℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器

4. 步骤：

(1)操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

(3)将新鲜培养基置于37 ℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

(4)取出冷冻管，立即放入37 ℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

(5)取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0. 1 ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml培养基之离心管内，离心1000 rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

(7)若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

三、细胞计数与存活测试

1. 原理：

(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

(2)血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1 mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0. 1 mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2×0. 1 mm=1. 0x10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每 ml中之细胞数目。

(3)存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。

2. 材料：

0. 4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0. 1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0. 05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100 mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。

3. 步骤：

(1)取50 μl细胞悬浮液与50 μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1. 5 ml小离心管中。

(2)取少许混合液(约15 μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

(3)计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每 ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ ml;每一大格的体积=0. 1 cm×0. 1 cm×0. 01 cm=10-4 ml

计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

4. 范例：

T75 monolayer culture制成10 ml细胞悬浮液，取0. 1 ml溶液与0. 1 ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55，62，49，59;死细胞数/方格：5，3，4，6;细胞总数=243

平均细胞数/方格=60. 75;稀释倍数=2;

细胞数/ ml：60. 75×104×2(稀释倍数)=1. 22×106;

细胞数/flask(10 ml)：1. 22×106×10 ml=12. 2×106

其实理论上讲处于细胞增殖期之前的细胞都可用于冻存，不过如果想要更好的效果，最好是取对数生长期的细胞，并注意做好冻存前的换液工作。温馨提示，从冻存管将细胞放入或取出时，都好做好保护工作，以免受冻。