qPCR进阶攻略——带你玩转qPCR仪器设置！

荧光定量PCR实验是分子实验室常用的一项技术。对于大多数久经沙场的老手而言，qPCR就是配一个反应体系丢到仪器里，静等一两个小时出结果即可；对于刚进实验室的小白而言，荧光定量PCR高手的进阶历程却路漫漫其修远兮。持续关注小翌的应该都掌握了高质量cDNA的获取方法，引物设计指南以及反应体系的配制技巧（还未get的小伙伴戳文末链接），然而上机时，发现和别人的反应条件不一致却又不敢动仪器？本期小翌将带你玩转qPCR仪器的设置！

目前市面上的qPCR仪器种类五花八门，但基本上仪器的设置都相对一致。我们以ABI 7500为例进行介绍。

1. 反应板设置

实验目的选择：我们将实验命名为“Yeasen”，进行“Quantitation： Δ Δ Ct”实验。

实验方法选择：如选用SYBR Green标记方法， 标准程序。

目的基因和模板的设置：每个Target和Sample命名，Target包括目的基因、内参基因，Sample包括实验组、对照组、负对照组。

反应孔的设置：根据样品的排布选中面板上的加样孔，勾选左边对应的目的基因及模板。

注意：不应为了方便将所有孔选成同一个Target同一个Sample，这样排布会造成比较大的风险。我们通过下面的例子进行说明：

我们同一块板上同时扩增两个基因，而布孔时选成同一个Target，那么仪器默认的都是同一个阈值，假如布孔时都选成Target1，红色这条阈值线对于Target1是合理的，但对于Target2则不合理，因为这时已经不在指数扩增期，得到的Ct值并不可信。

2. 反应程序设置

1）扩增程序

预变性

qPCR的模板可以是cDNA或gDNA，预变性这一步可以使双链DNA或cDNA-RNA结合物解链，以利于引物更好的和模板结合。另外在使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使反应得以顺利进行。如Yeaen Hieff系列定量产品的预变性设置为95℃ 5min。
变性

qPCR反应的产物比较短，一般10-30s的变性时间就已足够。
退火/延伸

qPCR反应可以将退火与延伸两步进行合并。条件需要根据引物和目的基因的长度进行调整，根据qPCR引物设计原则，引物的Tm值在60℃左右，因此这一步的温度一般可设为60℃。时间还需根据仪器使用要求进行设置，如ABI StepOne、Bio-Rad CFX96、Roche LightCycler 480至少需要设置30s，而ABI 7500则至少需要设置34s。
循环数

循环阶段从变性到退火、延伸，循环数一般设为40。
荧光信号采集

对于染料法而言，两步法检测的荧光信号采集应该在退火延伸的整合步骤；三步法应当在72℃延伸时采集，此时绝大部分的DNA是双链状态；Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。以ABI 7500为例，选择在哪一步采集荧光信号点亮其下面的小方块即可。

注：市面上不同公司生产的荧光定量产品的反应程序有所不同，建议根据说明书推荐的程序进行设置，以得到较好的扩增效率。

2）熔解程序

使用染料法进行荧光定量PCR时，我们通常会在扩增阶段完成后进行熔解曲线分析，帮助确定产物类型，判断是否有非特异性扩增的产生。以SYBR Green法为例，SYBR Green染料只有结合到双链DNA的小沟中才能发出荧光，扩增反应完成后，对产物逐渐升温同时监测每一步的荧光信号，随着温度升高，DNA双链解开，产物荧光信号下降。温度一般设置在60℃-95℃区间，能包含产物Tm值和非特异产物Tm值即可。在某个温度下，双链DNA会解链一半，此后剩下的一半会迅速解链，荧光骤降并形成变化的拐点，这个温度称为退火温度（Tm值）。将温度与荧光强度的变化求导作图(-dI/dT)，从而生成熔解曲线。

Tm值受产物长度，GC含量和离子环境等影响。因为目的产物长度在80-300bp，Tm值一般高于80℃，而引物二聚体比较小，大多Tm值低于75℃。而同一产物Tm值用不同品牌的试剂扩增时，Tm值会有所区别也是因为buffer成分的不同，如含有促解链的DMSO成分多，Tm值则相对低一点。

熔解曲线通常情况下可以使用仪器默认程序或者是仪器说明书上建议的程序，无需变动。

这几个步骤设置好，可以保存、修改或者直接点击“START RUN”进行反应。

3. 结果分析

阈值设置（可选）

Ct值是扩增曲线和阈值线的交点对应的循环数，阈值改变Ct值也会随之变动。但实际上，只要将阈值线设定在合适的范围内，任何两个样品间的△Ct值都会保持不变，依然可以依据△Ct值来计算不同样本间基因表达量的倍数变化。

阈值线不能太低，否则会受到噪音信号的干扰。反之，如果设置的太高，到达扩增线性期或平台期，数据则不准确，设置方法有两种：

A. 设为仪器默认值。点击Analyze（分析）按钮时，软件会自动为我们的实验设置好每一个Assay的最佳阈值线。

B. 手动设置。可按住阈值线上下拖动，需要设置在扩增曲线接近线性和线与线之间相互平行的位置，即样本重复性最好的区域，通常是在指数扩增期的中期或后期。

参比染料

ROX是qPCR实验中使用的一种参比染料，用于均一化校正仪器的光程差、移液误差或蒸发冷凝导致的体积差等，提高结果的重复性。ABI的仪器一般都需要在反应体系中添加ROX，结果分析时默认的是ROX，如果使用的Master mix里没有添加ROX，也可以勾选NO ROX分析。但考虑到移液误差、人为差异在qPCR实验中的常见性，建议根据仪器型号添加相应浓度的ROX。并且，ROX还可以作为故障分析的依据，无ROX信号，可以很明确地说明没有放置Master Mix试剂；ROX信号不规则变化，说明仪器可能存在故障。

Yeasen生物提供ROX混在Maste mix里面或不同浓度ROX单独成管的Master mix，完美兼容各种类型的定量仪器。