软琼脂细胞克隆形成实验

软琼脂细胞克隆形成实验说明：

   1）材料的准备和配置：

1) 准备2×基础培养基：去离子水溶解1 g粉末培养基和0.2 g碳酸氢钠，终体积为50 ml，0.2 μm滤器过滤除菌。

1) 在100 ml去离子水中加入1 g的琼脂，配制1%的琼脂。在100 ml去离子水中加入0.6 g的琼脂制备0.6%的琼脂。高压灭菌琼脂溶液，可储存在4°C，实验时应再次加热到琼脂完全溶解为止。

.2. 铺下层琼脂

1) 松开1%软琼脂的瓶盖，微波加热1-2 min，密切关注以防沸腾。继续加热，不时搅拌以混合，直到琼脂完全溶解至澄清。

2) 把融化的琼脂溶液和预热的2×培养基放在42°C水浴锅。6孔板每孔需要1.5 ml的琼脂与培养基的混合物。为了保证足量的混合物，每个6孔板准备12 ml混合物。首先加6 ml培养基到50 ml离心管中，再加6 ml的1%琼脂溶液。颠倒离心管几次以混匀，动作轻快以防软琼脂过早凝固。

3) 5 ml血清移液管每孔加1.5 ml混合物，避免气泡沉在底部。

4) 盖上板盖，室温凝固30 min。

3. 铺含有细胞的上层琼脂

1) 下层琼脂凝固后，开始准备上层琼脂。首先，胰酶消化收集细胞。细胞计数，制备细胞悬液。按1000, 3000, 5000个细胞/ml制备细胞悬液(使用2×完全培养基配置，每孔需0.75 ml细胞悬液和0.75 ml琼脂，共1.5 ml)。每孔按1.5 ml体积算，需要准备12 ml的细胞悬液。

2) 微波加热0.6%琼脂，把融化的琼脂溶液和3.3步骤制备的细胞悬液放在42°C水浴锅。

3) 按1：1比例混合0.6% 琼脂和细胞悬液，每个6孔板需要12 ml混合液。每孔1.5 ml。转移6 ml细胞悬液到50 ml离心管中。然后加6 ml 0.6%的琼脂。注意：混合液温度要保持42℃，避免凝固。

4) 动作迅速，用移液管吹打2-3次混匀混合液，然后用5 ml的血清移液管吸取5.5 ml的混合物。每孔加1.5 ml混合物，避免气泡沉在底部。

5) 细胞/琼脂混合物室温凝固30分钟，然后放入37℃细胞培养箱中。足够的菌落形成所需时间因每个细胞系而异，通常为21 d左右（本实验周期为14 d）。

6) 琼脂上层应保持一层生长培养基，以防止干燥。每星期加两次100 μl的培养基。

4. 平板染色和菌落计数

1) 每孔加200 μl结晶紫染色15-20 min。

2) 菌落染色后，用成像仪拍摄照片并用图像分析软件计算菌落数。