PCR该如何选择合适的DNA聚合酶？

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是分子生物学研究的核心技术，决定PCR反应成败的关键因素则是DNA聚合酶，它是PCR反应的核心成分。目前市场上的DNA聚合酶种类繁多，常见的有：Taq，Canace，Pfu，KOD，Phusion，Klenow、Bst、Phi29、Primerstar、Tth等。那么，什么样的片段该选择什么样的DNA聚合酶呢？

【一】选择PCR酶的关键因素：
 

1、热稳定性：DNA聚合酶能够耐受高温的能力，不同的DNA聚合酶的热稳定性差异较大，一般通过半衰期体现。

2、保真度：DNA聚合酶精确复制DNA模板的能力。部分DNA聚合酶具有3’-5’的核酸外切酶活性，能够校正错误碱基，保真度可通过错配率体现。

3、灵敏度：DNA聚合酶对低拷贝模板的扩增能力，可通过检出率体现。

4、特异性：DNA聚合酶在PCR过程中只扩增目的片段的能力，常通过抗体法或配体法等方式对DNA聚合酶进行修饰提升酶特异性。

5、扩增速度：DNA聚合酶向DNA新链中掺入核苷酸的速率，高扩增速率DNA聚合酶可加快整体实验时间。

（图片来源：DNA Replication-The Definitive Guide/Biology Dictionary）

【二】常用的DNA聚合酶及其应用：
 

① Taq DNA聚合酶：应用于常规PCR

Taq DNA聚合酶来源于Thermus aquaticus，热稳定性及扩增效率高，扩增速度为30-60 sec/kb，缺乏3’→5’核酸外切酶活性，无校正功能，易产生错配碱基。使用该酶扩增得到的PCR产物3’末端带A尾，可直接用于TA克隆。

② 高保真DNA聚合酶：应用于高保真PCR，如基因克隆、点突变、测序及SNP分析等

高保真DNA聚合酶是一类具有3’→5’核酸外切酶活性的酶，具有校正功能，扩增产物为平末端。当实验对保真度要求较高时，需选择此类酶。常见的高保真酶有Pfu、KOD、Phusion、Canace等。不同的高保真酶在保真度，扩增速度，扩增效率等方面有所差异。

翌圣生物Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase（Cat#10153ES）基于Pfu DNA聚合酶改造而成，其保真性是Taq酶的83倍，Pfu酶的9倍，扩增速度高达10 sec/kb，扩增目的片段长达13 kb，具有极强的扩增效率和广泛的模板适应性，非常适合复杂模板的高保真扩增。
 

图2. 翌圣10153ES Hieff Canace®高保真DNA聚合酶的保真性是Taq酶的83倍，pfu酶的9倍（测序法）。
 

③ 热启动DNA聚合酶：应用于高特异性PCR扩增，可在室温条件下配制反应体系

热启动DNA聚合酶是一类提高PCR反应特异性及灵敏度的酶。该类酶是通过抗体法或配体法等方式对DNA聚合酶进行修饰而成，使得DNA聚合酶活性在预变性温度下才被激活，可抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。

翌圣生物Hieff Union® Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase（Cat#10726ES）是利用双抗体进行双封闭的热启动DNA聚合酶，在预变性温度下加热30 sec封闭抗体即可完全失活，释放出DNA聚合酶活性和核酸外切酶活性，能有效防止错配或引物二聚体引起的非特异性扩增，抑制探针降解产生的荧光信号下降。

图3. 双封闭抗体可有效封闭Taq DNA聚合酶的外切酶活性。

图4. 与T公司抗体封闭Taq 酶对比，翌圣双封闭抗体Taq酶（10726ES）在ARMS-PCR扩增中分型准确，灵敏度更高。
 

④ 等温扩增DNA聚合酶：应用于等温扩增技术，如LAMP、CPA、RCA等

等温扩增DNA聚合酶是一类具有较强热稳定性、链置换活性及5’→3’聚合酶活性的酶，能在恒温条件下快速、高效、特异性的扩增模板，无需PCR热变性扩增循环。

翌圣生物升级Bst Ⅱ Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）具有5′→3′DNA 聚合酶活性及强链置换能力。与野生型相比，该酶的灵敏度、扩增效率、稳定性等方面均有大幅提高，同时增加了dUTP耐受性，可广泛应用于基于等温扩增技术。

图5. 与同类国外竞品N及国内竞品T对比，翌圣14402ES的灵敏度明显优于国内外竞品。
 

【三】产品选择指南