用于质谱鉴定的蛋白质凝胶样品酶解方法

SDS-PAGE蛋白条带酶解方法

1、用手术刀片切下胶上目标条带(或用自制切点器切下感兴趣的点)，置于EP管中（胶块切成约1 mm³大小），同时切下空的胶块作对照。

2、加入200-400 μL 100 mmol/L NH₄HCO₃/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干注：脱色液体积过量为好，脱色至透明，不必担心蛋白质的损失，因为完整蛋白质在此条件下很难被洗脱。

3、每管加入90 μL 100 mmol/L NH4HCO3，10 μL 100 mmol/L DTT，56 ℃孵化30分钟，还原蛋白质。

4、去上清，每管加100 μL 100%ACN，5分钟后吸去。

5、每管加入70 μL 100 mmol/L NH₄HCO₃，30 μL 200 mmol/L IAA（现配，避光保存），暗处20分钟。

6、去上清，每管加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3，室温15分钟。

7、去上清，加入100 μL 100%ACN，5分钟后吸去，冻干。

8、冻干后，各加入5 μL 2.5-10 ng/μL Trypsin溶液，置于4 ℃冰箱30-60分钟，使胶块充分吸胀（若仍有剩余液，吸出打掉）。

注：50 ng酶量基于考染一块胶1000 μg的上样量，12.5 ng基于银染一块胶100 μg的上样量。上样量增加，酶量同比增加，酶与被分析蛋白质质量比一般为1:20-1:100。

9、加入20-30 μL左右25 mmol/L NH4HCO3缓冲液（无Trypsin），pH 7.8-8.0（Promega）；

注：缓冲液体积视胶块体积而定，一般没过胶块20μL左右。

10、37 ℃反应过夜，20小时左右。

11、吸出酶解液，转移至新EP管中，原管加入100 μL 60% ACN /0.1%TFA，超声15分钟，吸出溶液，并入前次溶液，冻干。

12、样品制备完成，复溶（5 μL 0.1%TFA），点样，进行质谱分析。

双向电泳凝胶蛋白斑点酶解方法

1. 用合适口径的移液器枪头挖下凝胶上的目标斑点，置于进口EP管中。

2. 加入200-400 μL 100 mmol/L NH₄HCO₃/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干。

注：脱色液体积过量为好，脱色至透明，不必担心蛋白质的损失，因为完整蛋白质在此条件下很难被洗脱。若为银染，取30-50 μL 30mmol/L K3Fe(CN)6 : 100 mmol/L Na2S2O3=1:1(体积比) 加入胶块内，洗至蛋白质点棕色消失，去除上清，立刻加200 μL水终止反应，10分钟，去除上清，再加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3，静置20分钟，去除上清，冻干。

3. 冻干后，各加入5 μL 10 ng/μL Trypsin溶液，置于4 ℃冰箱30-60分钟，使胶块充分吸胀，若仍有剩余液，吸出打掉。

注：一般50 ng酶量基于考染一块胶1 μg的上样量，12.5 ng基于银染一块胶100 μg的上样量，上样量增加，酶量同比增加，酶与被分析蛋白质质量比一般为1:20-1:100。

4. 再加入20-30 μL左右25 mmol/L NH₄HCO₃缓冲液(无Trypsin)，PH 7.8-8.0 (Promega)，注：缓冲液体积视胶块体积而定，一般没过胶块20 μL左右。

5. 37 ℃反应过夜，20小时左右。

6. 吸出酶解液，转移至新EP管中，原管加入100 μL 60% ACN /0.1%TFA, 超声15分钟，吸出溶液，并入前次溶液，冻干。