干货分享 | 一文全面解读迷之又迷的260/280、260/230

发布时间：2023-03-03 16:32:23 I 企业名称：翌圣生物科技（上海）股份有限公司I 作者：

解决方案摘要

产品配置单

解决方案详情

一、迷之疑惑“260/230”、“260/280”

“PCR”、“qPCR”、“逆转录”、“一代测序”、“RNA-seq”等核酸下游实验如此常见，似乎每一个进行过这些实验的实验人员对“260/230比值”“260/280比值”都有一定的概念。但一千个读者就有一千个哈姆雷特，各家实验室可能自带一套流传已久、自圆其说的比值范围要求。

“1.8-2.0是比较好的，2.1有点偏高，有优化的建议吗？”

“有客户反应两个吸光度比值偏高，达到2.1。”

图1. 客户实验图

“对于RNA浓度测定，那260/280的差异一般在哪里”（在交流[Molpure Cell RNA Kit，货号19231]提取RNA结果时，某清华大学学生不禁发出了疑惑）

之所以出现上述疑惑，很大程度上，专业的试剂厂家也有不同的解读。

表1. 不同试剂厂家对比值解读

Thermo: It is important to note that the generally accepted 260/280 ratios of1.8 and 2.0 for DNA and RNA respectively, are "rules of thumb". The actual ratio will depend on the composition of the nucleic acid. The 260/230 values for “pure” nucleic acid are often higher than the respective 260/280 values. Expected 260/230 values are commonly in the range of 2.0-2.2.

NEB: In buffered solutions, pure dsDNA has an A₂₆₀/A₂₈₀ of 1.85–1.88 and pure RNA has a ratio of around 2.1. In buffered solutions, pure dsDNA has slightly higher A₂₆₀/A₂₃₀ ratios than RNA, with a value of 2.3–2.4 commonly reported for dsDNA and 2.1–2.3 for RNA. A₂₆₀/A₂₃₀ ratios typically produce a higher standard deviation than A260/A280 ratios and should be interpreted with care.

Qiagen: An A₂₆₀/A₂₈₀ratio of 1.8–2.1 at pH 7.5 is widely accepted as indicative of highly pure RNA. Pure RNA should also yield an A₂₆₀/A₂₃₀ratio of around 2 or slightly higher; however, there is no consensus on the acceptable lower limit of this ratio.

二、A₂₃₀、A₂₆₀和A₂₈₀都是啥、为啥要计算比值？

1、A₂₃₀、A₂₆₀和A₂₈₀

记不清是在物理课还是化学课上（理化不分家）学到的大名鼎鼎的“朗伯-比尔定律（Beer-Lambert law）”公式中，提出了吸光度值（absorbance，简写A）的概念，为了便于回忆，呈上公式：A=lg(1/T)=Kbc。

该公式是对下面客观事实的总结：某一化学物质可吸收一定波长的光，并且对光的吸收度（A）与此化学物质的浓度（c）成正比。因此，可以利用吸光度的大小来测定某种物质的浓度。

某一物质在某一个特定波长下的吸光度可用A_n来表示。

现在我们都知道了，A₂₆₀代表核酸在最高吸收峰260nm波长处的吸光度值，即260nm处的核酸最易“表现”自己，通过检测260nm处吸收的吸光度值最可评测纯化双链DNA、单链DNA或RNA样品的浓度（见图2）。

图2. 核酸吸光度谱

也可以看出核酸在220-300nm光谱范围内均可产生吸光度值，因此，核酸也有其对应的A₂₃₀、A₂₄₀、A₂₈₀值等。

与A₂₆₀类似，蛋白及其他物质各有各的吸收峰，我们需要关注到裂解液、结合液、漂洗液、洗涤液和洗脱液中会有TRIzol、硫氰酸胍、盐酸胍等离液盐、SDS、Triton X-100、Tween 20等去污剂、苯酚、EDTA、乙醇、异丙醇、NaCl等物质。

因此，我们现在也熟知了A₂₈₀最能反映蛋白质浓度（蛋白有多个吸收峰，A₂₈₀用的较多），A₂₃₀最能反映乙醇、GTC、GuHCl等的含量，A₂₇₀可用于苯酚浓度。

2、A₂₆₀/ A₂₈₀、A₂₆₀/ A₂₃₀比值

人们发现：“pure”DNA/RNA的吸光度值是可测量的，且“A₂₆₀/ A₂₈₀、A₂₆₀/ A₂₃₀比值”具有规律（见后续比值数据）。因此，约定俗成地认为，比值在一定程度上可说明DNA、RNA的纯度。但，这并不被NanoDrop厂家所认可（我们在干货分享 | NanoDrop测定的核酸浓度值，真的可信吗？一文中有提到）。

然而，测比值属于核酸质量评估最简单快速、经济实惠的方法之一！

三、理性讨论A₂₆₀/ A₂₈₀与A₂₆₀/ A₂₃₀的合理范围

1、撇开浓度去谈比值，纯属耍流氓

作为非利益方，美国NEB官方做过这样的一个测试：“a dilution series DNA of 150ng/µl down to 1ng/µl in TE buffer was analyzed to measure concentration and purity ratios”，评估NanoDrop^® One（这台仪器是Thermo家的）测定A₂₆₀/ A₂₈₀与A₂₆₀/ A₂₃₀的准确性。

最终得出结论：当低于50ng/µl，A₂₆₀/ A₂₈₀、A₂₆₀/ A₂₃₀比值波动非常大，应谨慎对待！当高于50ng/µl，比值波动小，测定值可信赖！