无血清细胞冻存液的制备方法
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细胞冻存及复苏是细胞培养技术中的重要技术，细胞冻存是细胞长期保存的重要手段。细胞冻存液，作为细胞冻存时必须使用的一种溶液，其作用是将需要冻存的细胞悬浮于冻存液，供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。在现有技术中，一般使用培养基、血清和二甲亚砜(dmso)按照一定比例混合的方法来冻存细胞，dmso用量为10％，过低的dmso浓度会导致冻存效果欠佳，但高浓度的dmso有较大毒性，会对细胞体造成伤害；且传统冻存液配方中所使用的血清成本高，增加动物病原污染的可能性。此外，有研究表明长期与胎牛血清接触的细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞，内吞胎牛血清后的间充质干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后可发生异种动物蛋白引起的免疫反应，不能直接用于临床输注。因此，利用含有血清的冻存液冻存的细胞会给临床使用带来一定的风险。
而目前市售无血清冻存液所使用的血清与dmso替代物包括甘油、壳聚糖以及海藻酸，所使用无血清培养基包括粘附因子、结合蛋白、生长因子、微量矿物元素、荷尔蒙、维生素，其添加物成分复杂，配制麻烦；本发明所提供细胞无血清冻存液所使用培养基为cd培养基，并在此基础上大大降低了冻存液中dmso含量，使其毒性降低，且无需使用成分复杂的dmso代替物。
技术实现要素：
本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种无血清细胞冻存液，本发明克服了传统血清冻存液含有动物源血清或高浓度dmso的缺陷，经济有效，且不会引入外源污染。用本发明的冻存液冻存的间充质干细胞及其他各类肿瘤细胞，细胞形态保存完好，具有很强的存活率和贴壁能力。
本发明是通过以下技术方案如下实现的：
一种无血清细胞冻存液，包括以下组分：cd培养基和二甲基亚砜(dmso)，所述cd培养基包含氨基酸、维生素、无机盐和水；所述维生素包括维生素b、维生素c和维生素d中的至少一种；所述cd培养基的具体配制方法为：称量不含有任何血清，动物源蛋白的化学限定培养基粉末到无菌玻璃容器中，加入高压灭菌ro水，充分搅拌，待粉末完全溶解后利用无菌的0.5-2.0mol/l的naoh调节ph为7.0-7.5，经0.22μm过滤器过滤后即制得cd培养基。
进一步地，所述cd培养基的质量体积比为90-99％，所述二甲基亚砜(dmso)的体积百分数1-10％，按以下体积份量进行配制：
cd培养基100份；
二甲基亚砜1-10份。
具体地，在生物安全柜无菌环境中取4℃保存的cd培养基100份，水浴环境下升温至室温；在生物安全柜无菌环境中取二甲基亚砜1-10份；在常温、安全柜无菌环境中混合cd培养基和二甲基亚砜，配置成终浓度为含90-99％cd培养基及1-10％二甲基亚砜的冻存液。
进一步地，所述氨基酸包括赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸中的至少一种。
进一步地，所述无机盐包括钙、磷、钾、钠、氯、镁、硫的磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、碳酸盐和盐酸盐中的至少一种。
进一步地，所述的二甲基亚砜(dmso)为临床级细胞冻存渗透性保护剂。
具体地，细胞与上述冻存液的混合方法为：在5×106个细胞中加入1.5份无血清冻存液，然后进行细胞重悬，将细胞悬液加入到冻存管中，冻存管置于已处于常温状态的程序降温盒中，再将程序降温盒放置于-80℃超低温冰箱过夜，第二天转移至液氮罐冻存架中保存，备用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
a.本发明提供了一种制备方法简单、成本低廉、低毒性、细胞复苏后成活率高、污染风险低的无血清冻存液。
b.该冻存液需现配现用，细胞复苏后无需倒掉冻存液后再培养，可直接将其加入到培养液中，至长满后传代或使用，方便快捷；
c.该细胞冻存液不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，采用该冻存液经冻存复苏后的细胞，存活率达80-90％、贴壁生长好、纯度高、分化能力强，可用于继续培养或临床直接回输，安全有效，在临床上具有良好的应用前景。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员是显而易见的，根据本发明的信息作出的改变，替代等均是可行的，因此其也在本发明范围内
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