IND申报利器丨mRNA加帽率方法学验证Standard
成熟mRNA的结构主要有五个部分，包括：5'帽子结构（5'Cap）、5'非翻译区（5'UTR）、编码蛋白的开放阅读框、3'非翻译区（3'UTR）和PolyA尾。针对mRNA的规模化生产，目前较为高效的方式是体外转录（IVT）。mRNA结构及其生产工艺的复杂性，使mRNA候选产品的分析要求比传统生物制品的分析要求更具挑战性，但是精准分析mRNA产品的各类指标可以评估mRNA的功效和安全性，由此，分析方法的开发与验证至关重要！
图1 mRNA结构式示意图[1]
帽子结构对mRNA来说至关重要，它不仅可与真核生物翻译起始因子(eIF4E)结合来启动翻译，而且还能保护mRNA不被核酸外切酶降解，同时可促使mRNA环化形成空间结构，增强稳定性。mRNA加帽率检测毫无疑问是mRNA生产工艺质量分析里面最关键的指标之一，那么对加帽率检测方法的验证与评估举足轻重！
图2 mRNA翻译帽依赖机制示意图[2]
由于全长mRNA分子量巨大，质谱无法采集大片段完整mRNA信号，因此，工艺生产中常采用的加帽率测定方法是基于RNase H介导的探针切割法。该分析方法基于链霉亲和素磁珠特异性捕获生物素标记的探针，mRNA 5’端序列与探针结合，从而被RNase H识别并切割，经过清洗、洗脱得到mRNA 5’端单链寡核苷酸序列。然后通过LC-MS对不同片段的mRNA分子量和结构进行表征，从而定量评估mRNA的加帽率！
图3 RNase H介导的探针切割原理示意图[3]
对于不同的mRNA药物，其加帽率检测方法会有所不同，因此对其方法学进行准确性验证至关重要，但是方法学验证的准确性考察是一个比较大的挑战！申基生物不仅可以对mRNA加帽率检测方法进行方法学验证，同时可以定制加帽率检测方法验证标准品，即Cap1标准品以及Uncap标准品，从而辅助验证加帽率检测方法的准确性和有效性，助力mRNA药物IND申报！
图4 Cap1标准品以及Uncap标准品纯度检测图
对于自研Cap1标准品以及Uncap标准品，申基生物按照对应标准品的摩尔比例进行混合，然后进行加帽率检测方法学验证中的线性水平及准确度考察，结果表明，申基生物加帽率验证标准品不仅具有优异的线性关系，而且具有多水平的准确度！
图5 Cap1标准品以及Uncap标准品优异的线性与多水平的准确度
小结
5’帽结构可维持体内mRNA稳定性，促进蛋白的翻译。带帽结构的mRNA占比高可优化其免疫原性和翻译效率的问题，因此加帽率是mRNA疫苗或药物的关键质量指标。申基生物作为国内领先的mRNA原料供应商，不仅具有自主知识产权的帽类似物原料，同时提供mRNA加帽率检测服务；与此同时，申基生物也可以定制Cap1标准品以及Uncap标准品，全方位满足客户对mRNA加帽不同的需求，助力核酸药物的研发以及商业化进程！
参考文献
[1] Namit Chaudhary, Drew Weissman, Kathryn A. Whitehead. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation[J]. Nat Rev Drug Discov. 2021: 1–22.
[2] Montero H , R Garcí, Mora S I . eIF4E as a Control Target for Viruses[J]. Viruses, 2015, 7(2):739-750.
[3] Beverly M, Dell A, Parmar P, et al. Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem[J].2016, 408(18):5021-5030.
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