慢病毒包装与浓缩Protocol详细指南

慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。通过包装的慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA，被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装shRNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而效率高地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。

一：慢病毒包装过程

1.293细胞密度接近90%左右时进行传代，加入37℃预热的胰酶进行消化，将消化离心混匀后的细胞种于10mm培养皿。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育24h,当细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的50％以上时转染慢病毒质粒。

2.取两个无菌1.5mlEP管，分别加入200µl无血清DMEM，其中一个EP管内加入1.5µg含有目的基因的病毒载体核心质粒和1.5µg病毒包装质粒，病毒包装质粒可按照pMDL:VSVG:REV=5:3:2比例加入；另一个EP管中加入6µl lipo2000。

3.静止5分钟。然后将两管充分混匀，静置15-20min。

4.将步骤3中的混合液逐滴加入细胞培养皿中，轻轻摇动平皿混匀，然后置于含5％CO2的37℃温箱孵育。

4. 10h-16h后吸去培养基，加入适量37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育。

5.转染后24h、48h、72h左右收集含慢病毒的上清。1500rpm离心五分钟。

6.将待转染的实验细胞平铺于35mm培养皿，12-24h后换液，较佳密度为30%－50％。第一次加入转染后24h收集的病毒液培养。可根据情况进行病毒液的再次感染。细胞长满后传代或者检测表达。

如果一次包装的病毒液体积较大，可以通过PEG8000进行慢病毒液的浓缩，PEG 是环氧乙烷和水缩合而成的水溶性非离子型聚合物， 多用于浓缩病毒。

二：慢病毒浓缩过程

1. 配制5X PEG8000：

NaCl 8.766 g;

PEG8000 50g；

200ml Milli-Q纯水；

溶解后将液体至于121℃ 高温灭菌30min；将灭菌后母液保存在4℃。

2. 使用0.45μm滤头过滤转染后24h、48h、72h左右收集含慢病毒的上清液；

3. 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 NaCl母液7.5 ml；

4. 每20～30min混合一次，8字摇匀，共进行3-5次；

5. 4℃放置过夜；

6. 4℃，4000 g，离心 20min

7. 吸弃上清，静置管子1～2min，吸走残余液体；

8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；

9.将溶解病毒悬液分装，储存在-80 ℃，按需取用。