WB实验原理及FAQ
一、Western Blot实验原理是什么？
Western Blot即蛋白质印迹法，又称（immunoblotting），是定性、定量检测蛋白表达的常用技术方法之一。WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相载体（NC膜或PVDF膜），并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物（即总蛋白混合物）中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析，旨在鉴别特异性蛋白的类型（如亚型、聚体、剪切体等）和蛋白表达量的变化。
二、Western Blot实验步骤是什么？
SDS-PAGE步骤完成后，进行Western Blot操作，具体实验步骤描述如下。
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步骤名称 |
主要操作 |
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实验准备 |
剪刀、镊子、硝酸纤维素NC膜、滤纸、冰袋、一盆冰、白黑夹子、海绵 |
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一个与胶块般大小的NC膜，同样，剪同样大小的4块滤纸。按照黑板一海绵一2层滤纸一胶块一NC膜一二层滤纸一海绵一白板。双手捏住黑白夹子两侧将其夹紧，以上在转膜液中操作。 |
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转膜 |
将夹子、外盒装配好。电泳仪没置: 300mA。根据目的蛋白的大小来决定转膜时间。蛋白小时间就30min左右，蛋白大时间就得相应增加。 |
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封闭 |
转后的NC膜/PVDF膜拿出后，在TBST中洗一洗。 |
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配制封闭液：2.5g脱脂奶粉+50ml TBST，摇均匀。将NC膜转到含有封闭液的10cm玻璃皿中，室温，80rpm 2h。 |
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孵育一抗 |
将封闭液回收，加入一抗稀释液。4℃ 慢摇2h或者过夜。一抗的稀释：按照1/1000或者1/2000。 |
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洗涤 |
TBST洗涤3次，一次15min。 |
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孵育二抗 |
回收一抗稀释液，加入二抗稀释液。室温，慢摇2h。 |
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洗涤 |
TBST洗涤3次，一次15min。 |
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显色 |
准备：将显色仪提前0.5h打开，准备纸巾、镊子、ECLA＆B1.5ml离心管。 |
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将显色液A＆B按照1:1混合。一般配制1ml足够。 |
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用镊子从TBST中取出膜，在黑板上，一侧先触底，缓缓放下。滴加A＆B混合液，均匀滴在膜表面。 |
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显色仓中有两层：上层显示“内参与靶条带”，下层显示Marker,Marker需用‘cutom’中的protocol显色。 |
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图像：“TIF”和“JPG”两种格式各一张。 |
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膜再生 |
倒入膜再生液，室温，80rpm，30 min。 |
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洗涤 |
用TBST洗3次，每次10min。 |
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封闭 |
将TBST倒出，倒入封闭液，室温，80rpm,2h。 |
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孵育一抗 |
加入一抗稀释液。4℃，慢摇过夜。到时回收一抗稀释液。 |
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洗涤 |
用TBST洗3次，每次10min。 |
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孵育二抗 |
加入二抗稀释液，室温，慢摇，2h。到时回收。 |
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洗涤 |
用TBST洗3次，每次10min。 |
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显色 |
步骤详见上面显色描述。 |
三、Western Blot实验中可能出现的问题及对策：
目前，Western Blot因其便捷的优点，加之电泳及电转设备、抗体和信号检测系统的成熟商品化，多种技术不断进步共同提高了检测的灵敏度，使得Western blot技术成为几乎每一个进行蛋白质研究的实验室至关重要的实验之一。在一般的实验室中都能够进行Western blot技术操作，但在实验过程中也会经常遇到各种问题。
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实验问题 |
可能原因 |
推荐办法 |
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1.目的条带未显现 |
目的蛋白的表达量过低 |
提高上样量，浓缩目的蛋白，采用更高灵敏度的试剂盒 |
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使用抗体 效价不足 |
使用新配制的一抗，避免反复冻融；增加一抗或者二抗浓度，适当延长孵育时间 |
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转膜效率低 |
选择合适的转膜方式，提高转膜效率（根据蛋白分子量大小调整转膜时间） |
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2.非平行、弯曲条带 |
电泳迁移速度过快或迁移温度过高 |
调整电泳设置如PH值、电压等，电泳时降低环境温度（用冰盒包围住电泳槽）。 |
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3.背景过高 |
封闭条件不合适 |
延长封闭时间或更换封闭剂 |
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抗体浓度过高 |
降低一抗/二抗浓度并延长 孵育时间 |
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抗体与封闭剂 发生交叉反应 |
加温和去污剂如Tween20 |
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4.条带糊 |
抗体特异性不强 |
使用更特异更优的抗体 |
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膜洗涤不完全 |
调整洗涤摇床转速、时间，配制新鲜洗涤液 |
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电泳仪、转膜液使用次数太多 |
按照溶液配制标准配制全新的电泳液、转膜液 |
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5.显色不美观 |
曝光时间过长 |
显色时根据经验选择曝光时间，可以多试几次，时间由少到多 |
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操作过程中手碰到了膜 |
操作小心，全程用镊子抓取，避免任何别的形势的触碰 |
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