如何有效的开展动物睡眠剥夺实验呢

虽然早已知道，睡眠在人类及哺乳animal的生命活动中具有十分重要的生理意义，但迄今为止，睡眠发生的确切机制却尚未完全阐明。根据睡眠时的脑电图、肌电图及眼球运动表现，可将睡眠分为非快速眼球运动睡眠（ nonrapid eye movements，NREM）和快速眼球运动睡眠（ rapid eye movement，REM）或快波睡眠。睡眠剥夺（ sleep deprivation）是研究睡眠的功能与发生机制的重要方法，睡眠剥夺模型的选择，将直接影响睡眠剥夺实验的可靠性及准确性，对睡眠剥夺实验结果具有重要的影响。现将几种常用的rat睡眠剥夺模型的方法、评价及进展情况综述如下。

1 平台睡眠剥夺技术（ platform technique）

此类方法又称为花瓶技术（ flower pot technique），主要是利用rat畏水及在水中无法进入睡眠的生活习性，通过在盛水的水槽中放置平台，让rat站立在平台上，因平台直径足够小（直径6.5cm或更小），当rat进入REM时，因全身肌张力降低引起节律性低头、触水，以此来达到剥夺REM的目的。此类方法简单易行，无需复杂昂贵的设备，在不同条件的实验室均能开展，因而应用广泛。其主要用来剥夺rat的REM，可分为以下三种方法：

1.1 单平台睡眠剥夺法（ single platform method，SP）

此方法最早于1964年由 Jouvet等应用在猫的睡眠剥夺实验中，不久以后， Cohen将此方法应用于rat的睡眠剥夺实验。方法为将一圆柱形小平台（直径约65mm），放置在长400mmx宽340mmx高160mm的水槽中，往水槽中加水，至平台露出水面约10mm，将1只rat置于小平台上，rat可在平台上站立，可入NREM。当rat进入REM时，全身骨骼肌张力明显降低，颈部肌张力降低引起节律性低头、触水，从而无法进人REM。采用SP实验可引起animal的体重及胸腺重量减轻、肾上腺重量增加、血浆中肾上腺皮质酮（CORT）增加、animal攻击行为增加、机体免疫反应抑制等。因SP是单只rat进行实验，且在实验中rat的活动空间受限，故有学者认为以上的临床与实验室表现可能与rat的群体隔离或活动空间受限有关。进一步研究发现，在实验前群体饲养的animal，当与群体隔离后也会出现攻击行为增加、血浆中CORT增加、免疫功能抑制等表现，rat活动空间受限也可引起血浆中CORT的水平的增加。这些结果与单平台睡眠剥夺实验中见到的类似。为克服SP中rat与群体分离及活动空间受限的缺点，在SP基础上进一步发展为多平台睡眠剥夺法。

1.2多平台睡眠夺法（ multiple platform method，MP）

MP法由 Van Hulzen等于1981年最先应用在rat睡眠剥夺实验中。在MP中，为扩展rat的活动空间，将小平台由SP中的1个增加至7个，仍将1只rat放在小平台间进行睡眠剥夺试验。因rat可以在7个小平台间自由活动，故活动范围较SP中有明显增大。经实验比较，在MP中，反映应激增强的一些指标，如肾上腺重量增加和胸腺重量减少仍然存在，甚至在rat血液中 ACTH,CORT的增加及肾上腺重量的增加较SP的更高，提示MP较SP有更强的应激性。考虑到rat为群居animal，单只rat实验易导致与所在群体的隔离。为克服群体隔离所带来的应激反应，有学者将MP法进一步改良，发展为改良多平台睡眠剥夺法。

1.3 改良多平台睡眠剥夺法（ modified multiple platform method, MMPM)

在MMPM中，将10只rat（具体数目可根据实际需要确定）同时放在装有14或15个小平台的水槽中（长127cmx宽44cmx高45cm）进行实验，这样既避免了SP、MP中单只rat与群体隔离的缺点，又保留了MP中活动范围增大的特点。因在实验时rat多是3只或4只一笼进行饲养，如1组实验需10只rat，则需要3笼或4绝rat。考虑到来自不同笼中饲养2周，实验时再将这些rat放在一起同时进行睡眠剥夺实验，这样以克服实验时rat群体不稳定的缺点，从而将实验时的不确定因素减至最低。实验研究发现，在MMPM中，经采取措施保持rat群体稳定性及避免rat与群体分离后，rat肾上腺重量、体重减轻量、血清中促肾上腺皮质激素（ACTH）和肾上腺皮质酮（CORT）的含量均较MP中为低，提示MMPM较MP具有更低的应激性，是较为理想的REM剥夺方法。

2 强迫运动睡眼剥夺法（ forced locomotion technique）

此类睡眠剥夺方法形式多样，在脑电监护情况下可行全部的睡眠剥夺（ total sleep deprivation，TSD）和选择性的睡眠剥夺（ selective sleep deprivation，SSD）其共同特点是通过动力装置，迫使rat不停地运动，从而达到睡眠剥夺的目的。此类方法的优点是睡眠剥夺效果明显，睡眠剥夺的时间及强度易于掌、重复性好，无须实验人员随时观察实验情况，减轻了实验人员工作强度。缺点是长时间运动引起机体的一系列应激反应，可能干扰睡眠剥夺的实验结果。现选取其中两种有代表意义的方法介绍如下。

2.1水平转盘睡眠剥夺法（ large round horizontal platform method)

此方法应用广泛，又称为disk-over- water method、由 Rechtschaffen等于1983年最先应用在睡眠剥夺实验中。实验装置由一个电脑控制台、一个水平转盘及两个开放的长方形有机玻璃缸组成。转盘直径为46cm，在电脑控制下可以按顺时针、逆时针方向随机水平转动。两只有机玻璃缸的尺寸均为长60cmx宽20.5cmx高60cm，在距离缸底5cm处的缸侧壁开有一条缝隙，使转盘的一半能分别从缝隙伸入两只玻璃缸中，并能随意转动。缸底留置水约2cm深，转盘离水面约3cm。实验前1周将睡眠剥夺rat头颈部植入微电极，并将微电极与电脑控制台相连。将rat放在转盘上适应环境1周，每天约1h，让rat习惯在转盘上活动、进水、进食等。实验时将实验组的rat及对照组的rat分別置于两只缸中的转盘上，当电脑通过微电极监测到实验组rat进入慢波或快波睡眠的脑电信号后，立即发出指令使转盘转动6s（6s内转动1/3圈），当rat被转到玻璃缸壁时，因被玻璃缸壁挡住而可能掉入水中。每次在实验组睡眠剥夺rat进人睡眠时转盘即转动6s，方向随机，转盘转动时两只rat均被动地随着转盘移动。此方法一次只剥夺一只rat睡眠，当实验组的睡眠剥夺rat在运动，进食时，转盘并不转动，而此时对照组的rat则可以趁机睡觉，以弥补被剥夺的睡眠。此方法中睡眠剥夺组rat与对照组rat条件极其相似，因而可减少因实验条件不同而所致的应激反应，可进行TSD和SSD实验。

2.2 旋转圆筒睡眠剥夺法（ rotating drum method）

此方法于1979年由 Alexander等最先应用于睡眠剥夺实验中。设备主要由一柱形圆筒及一小型慢速马达构成。圆筒直径30cm，高30cm，圆筒底由PVC（聚氯乙烯）构成，侧壁由直径为10.4mm的PVC杆围成，杆长度30cm，杆之间间隔15.5mm，圆筒与小型马达相连，马达转速为每45s转1圈（也有学者应用每min转1圈）。至少在实验前2d，每天将rat放入圆筒中适应环境1次，适应时间不少于3h。实验时将马达按45s1圈进行匀速转动，通过圆筒的转动带动rat不停运动而达到睡眠剥夺的目的。此类方法简单易行，睡眠剥夺效果明显，缺点是长时间不停运动，可引起机体的运动后应激反应及身体疲劳，可能干扰睡眠剥夺实验结果。此类方法发展出多种变化Marcos等在进行新生rat睡眠剥夺时将简旋转速调节至2-3 r/min，后期逐渐增加至6-7 r/min， Shen等将圆筒在30s内旋转180°，每5min旋转一次以达到睡眠剥夺的目的。

 3 轻柔刺激法（ method of gentle handling）

      此方法在短期的睡眠剥夺实验中应用较多。当实验人员通过观察rat行为或通过脑电波监护观察到rat进入睡眠时，通过轻轻拍打rat笼子，或应用声音、光线的刺激促使rat保持清醒，必要时还可用纸卷、铅笔或用手直接触摸rat，使rat无法进入睡眠。注意不能将rat移出笼外。此方法简单易行，在脑电监护情况下可进行TSD或SSD实验。在无脑电监护时，需要实验人员在旁不间断观察rat行为，易导致实验人员的睡眠剥夺，故较适合较短时间的睡眠剥夺实验。

 4 药物睡眠剥夺法

      定时给rat注射药物（多为一些中枢兴奋药），也可剥夺部分或全部睡眠，如注射咖啡因、去氧麻黄碱、特殊的神经毒素（DSP-4）、可乐定等。此类方法简单易行，操作方便，不需要特殊仪器。缺点是rat存在个体差异，睡眠剥夺的效果及程度及不易掌握。多用在研究某些特殊药物药理作用的实验中。