组织芯片使用手册

一、组织芯片简介        

二、组织芯片优势        

三、组织芯片的制备流程        

四、组织芯片使用指南        

1、产品规格        

2、使用前准备        

3、组织芯片应用        

3.1.        免疫组化（IHC）        

3.1.1        实验主要试剂        

3.1.2        实验主要仪器        

3.1.3        免疫组化抗体列表        

3.1.4        免疫组化染色实验步骤        

3.1.4.1        脱蜡和水化        

3.1.4.2        抗原修复 （用于石蜡包埋组织芯片）        

抗原热修复        

酶消化方法        

3.1.4.3        免疫组化（IHC）染色        

3.2.        RNAscope（RNA原位杂交）        

3.3.        其他用途请参照FFPE样本实验方法        

3.4.        组织芯片SCI撰写范例        

3.5.        VisioPharm病理分析判读        

 

 

 

一、组织芯片简介

组织芯片是一种新型的高通量、多样本的研究工具。它将数十个甚至几百个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上，为医学分子生物学提供了一种高通量、大样本以及快速的分子水平的分析工具。

研究者一次可有效利用成百上千份自然或出于疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的相关关系，对于疾病的分子诊断，预后指标和治疗靶点的定位，抗体和药物的筛选等方面均有十分重要的实用价值。

二、组织芯片优势

三、组织芯片的制备流程

1.                      病理标本行切片、HE染色、病理复诊，并标记实验所需组织的范围；

2.                      按照实验目的设计组织芯片阵列的组织类型和排列方式；

3.                      根据复诊标记及阵列设计选择对应的组织病例编号；

4.                      按照组织病例编号从组织库中取出组织蜡块和对应的HE染色切片；

5.                      制备合适的空白受体蜡块；

6.                      按照阵列设计利用组织阵列仪抽提病理蜡块组织芯并有规律的排列在空白受体蜡块上，制备组织阵列块；

7.                      组织阵列块在52℃恒温烤箱中加热融合，使组织芯与受体蜡块紧密融合；

8.                      全自动组织切片机以20μm/转的进刀速度对组织阵列块修整蜡块，直至80%的组织芯完全曝露；

9.                      全自动组织切片机以4μm /转的进刀速度对组织阵列块切片，切片裱附在防脱处理的载玻片上；

10.                    组织芯片沥干水分后，置于60 ℃恒温烤箱中烤片16个小时；

11.                    组织芯片按编号每隔20张抽取一张作HE染色；

12.                    病理医生对抽检组织芯片中每一个组织样本进行复诊质检，结果由信息部输入组织芯片数据库；

13.                    组织芯片白片敷蜡后，置于冰箱4 ℃冷藏室保存。

四、组织芯片使用指南

1、产品规格

产品规格	基片类型	备注
组织芯片正式片	Thermo 4951Plus玻片	标配1张
组织芯片预实验片	世泰防脱玻片	标配1张

2、使用前准备

使用前将组织芯片垂直放于玻片盒内，如下图所示： 60℃左右烘烤2~3小时将表面封蜡融掉。（可根据实际情况延长融蜡时间）。

3、组织芯片应用

3.1.                      免疫组化（IHC）

3.1.1                      实验主要试剂

3.1.2                      实验主要仪器

 

3.1.3                      免疫组化抗体列表

3.1.4                      免疫组化染色实验步骤

3.1.4.1                      脱蜡和水化  

Note！脱蜡前将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2~3小时  

1)        置于二甲苯I中浸泡10分钟，在二甲苯II中浸泡10分钟，在二甲苯III中浸泡10分钟，在二甲苯Ⅳ中浸泡10分钟；  

2)        无水乙醇I中浸泡5分钟在无水乙醇II中再浸泡5分钟； 

3)        95%乙醇中浸泡5分钟； 

4)        85%乙醇中浸泡5分钟；  

5)        70%乙醇中浸泡5分钟； 

6)        蒸馏水中浸泡5分钟；

 

 

 

 

 

3.1.4.2                      抗原修复 （用于石蜡包埋组织芯片）

抗原热修复 

A、高温高压热修复 

取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于压力锅中大火加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖扣上压力阀继续加热至喷气，从喷气开始计时1-2分钟后压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后，用PBS洗5分钟。 

B、微波热修复

取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于微波盒中微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中中，高档继续处理10-15分钟，取出微波盒冷却至室温，取出玻片先用蒸馏水洗两次，后用PBS洗5分钟。

酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶，使用前酶预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间为10-30分钟

3.1.4.3                      免疫组化（IHC）染色

1)                      脱蜡水化；

2)                      PBS洗3次，各6分钟； 

3)                      抗原修复；

4)                      用蒸馏水配置新鲜的3%H2O2-甲醇室温封闭10分钟；  

5)                      PBS洗3次，各6分钟； 

6)                      滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟； 

7)                      甩去多余液体滴加一抗4℃过夜；

8)                      37℃复温45分钟； 

9)                      PBS洗3次，各8分钟；

10)                    滴加二抗，室温30分钟；

11)                    PBS洗3次，各8分钟； 

12)                    DAB显色10分钟在显微镜下掌握染色程度； 

13)                    蒸馏水洗终止染色；

14)                    苏木素复染，盐酸酒精分化； 

15)                    脱水透明封片镜检；

Note! 上述冲洗步骤切勿直接对着组织冲洗，冲洗时力度要适中，以免组织芯片掉片。

3.2.                      RNAscope（RNA原位杂交）

前准备工作	使用前将组织芯片垂直放于玻片盒内，60℃左右烘烤2~3小时将表面封蜡融掉。
试剂准备	1、清洗液 200ml 二甲苯 2缸； 2、染色液 200ml 100%酒精 2缸； 3、70% 酒精1缸； 4、50%苏木精，0.02%氨水（返蓝用）； 5、修复液：向烧杯中倒入 1 瓶 (70 mL) 10X RNAscope® 靶标修复试剂，然后加入 630 mL 蒸馏水，混合制备得到 700 mL 1X RNAscope® 靶标修复试剂。 6、1*冲洗液：60ml 5*wash buffer+2.94L蒸馏水，用前孵育至40℃；
脱蜡	1、浸入二甲苯缸5min，2次； 2、浸入无水乙醇1min，1次； 3、室温晾干或者过夜晾干；
前处理	1、烘箱（杂交炉）温度调至40℃，湿盒提前30min放入； 2、准备700ml修复液，用前（30min内使用）略微煮沸； 3、每张片子滴加双氧水5-8滴，室温下阻断10min； 4、流水冲；
酶消化	1、切片放入修复液，微波修复15min； 2、用镊子立即将热载玻片架从 1X RNAscope® 靶标修复试剂中转移到盛有蒸馏水的染色皿中。请勿在RNAscope® 靶标修复试剂中冷却载玻片。 3.100%酒精冲洗 3-5次，室温晾干； 4、组化笔将待检测区域圈出； 5、切片上滴加5滴RNAscope® 蛋白酶 plus，使其完全覆盖组织； 6、湿盒40℃，温预30min；【Assay可冰箱取出，准备杂交】 7、流水冲；
探针杂交	1、每张切片加4滴探针溶液[探针用前40℃温预10min，取出自然冷却至室温]； 2、40℃，湿盒孵育2h； 3、后将载玻片放入浸没在盛满 1X 清洗缓冲液的清洗皿中不时地上下移动载玻片架以清洗载玻片，2次，每次2min；
其他杂交试剂Amp1-6 1/3/5 杂交 30min 2/4/6 杂交15min	1、甩干玻片，加4滴Amp1； 2、40℃温预30 min； 3、1*洗液冲洗2次，每次2min； 4、甩干玻片，加4滴Amp2； 5、40℃温预15 min； 6、1*洗液冲洗2次，每次2min； 7、甩干玻片，加4滴Amp3； 8、40℃温预30 min； 9、1*洗液冲洗2次，每次2min； 10、甩干玻片，加4滴Amp4； 11、40℃温预15 min； 12、1*洗液冲洗2次，每次2min； 13、甩干玻片，加4滴Amp5； 14、室温，温预30 min； 15、1*洗液冲洗2次，每次2min； 16、甩干玻片，加4滴Amp6； 17、室温，温预15 min； 18、1*洗液冲洗2次，每次2min；
检测信号	1、快速离心 RED-B 管，确保开盖前内容物聚集在试剂管底部。 2.根据疏水圈的大小，按照RED-B:RED-A=1:60的比例制备RED工作液。现配现用 2、每张切片滴加120 µL RED，室温10min； 3、流水冲；
计数染色	1、将片子浸入50%苏木精2min； 2、取出，流水冲； 3、0.02%氨水返蓝10秒；流水冲； 4、从清洗皿中取出载玻片架，在 60℃干燥箱中干燥载玻片 15分钟（至载玻片完全干燥）； 5、在载玻片上滴 1-2 滴 VectaMont，封片剂、干燥；

3.3.                      其他用途请参照FFPE样本实验方法

其他组织芯片研究项目（如mIHC、ISH、FISH）请参照相应试剂盒FFPE样本应用进行。

3.4.                      组织芯片SCI撰写范例

  我们公司的英文全称为： Shanghai Wellbio Technology Co., Ltd (Wellbio Technology Co.,Shanghai, China).为了便于描述，我们将已发表客户文章概括如下：

     Tissue microarrays were constructed by Shanghai Wellbio Technology Co., Ltd (Wellbio Technology Co.,Shanghai, China). Pathologists stained tissue paraffin blocks of EC samples from test and validation cohorts with hematoxylin–eosin to confirm the diagnoses and marked at fixed points which displayed the most typical histological characteristics under a microscope. Cores with 1.0-mm diameter from per-donor block were diverted into a recipient block microarrayer, and each dot array contained fewer than 220 dots. Four-micrometer-thick sections were cut from the recipient block and diverted to glass slides used with an adhesive tape transfer system in order to ultraviolet cross linkage.

 

或者

Tissue microarrays

Commercially available adult human normal tissue arrays were obtained from Shanghai Wellbio Technology Co.,Ltd (Wellbio Technology Co.,Shanghai,China).Tissue array contained 33 points of a 1.5mm-diameter disk of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues representing histological normal organs from individuals aged 25-75 years. The following samples were absent from in the arrays and additional cases were obtained and examined as standard histological sections: lymph node (5 cases), esophagus (6 cases).

 

或者

Tissue Microarray and Immunohistochemistry.

Three tissue microarray (TMA)chips containing a total of 188 pairs of tumors and matched adjacent tissues were obtained from Shanghai Wellbio Technology Company Ltd.----------

3.5.                      VisioPharm病理分析判读

Ø                      细胞核检测–-根据颜色输入和阈值，将指定类型的细胞核分为两类。

Ø                      细胞膜检测—检测和标记细胞膜结构，例如用于连接定量

Ø                      细胞质检测—检测并标记细胞的细胞质。

VisioPharm软件分析步骤：

1、       病理切片扫描

IHC病理切片/组织芯片日本滨松（NanoZoomer）病理扫描仪s210进行400倍全景扫描；

2、       扫描数据导入

将扫描后的文件整体导入Visiopharm分析软件；

3、       标记ROI（Regions of interest）区域

A.       大切片  利用Visiopharm画图工具将待分析区域进行标记，对于多个感兴趣的区域可用多种颜色进行标识，最多可达255种；

B.       组织芯片 利用Visiopahrm软件中Tissuarray模块，将导入的组织芯片自动套圈，按照行（A、B、C----）、列（1、2、3---）坐标形成单芯数据存入数据库。

4、       预览及训练App参数

待分析切片预览区域FOV（ACTIVE FIELD OF VIEW）调用相关App，通过调节阀值、像素点大小、灵敏度等App参数，使分析区域分析结果与实际效果相符，保存App参数设定。

5、       运行App

A.       典型胞浆染色  套用Cytoplasm分析App，分别输出阳性细胞面积、ROI总面积、阳性占比、阳性染色强度；

B.       典型胞膜着色  套用Membrane分析App，分别输出细胞膜链接度（conectivity），根据链接度进行score评分，分为0~4级；

C.       典型细胞核染色    套用Nuclei分析App，分别输出阳性细胞数、阴性细胞数、细胞总数、阳性细胞占比、强/弱细胞染色强度。

D.       胞浆、胞核、胞膜同时有染色时，套用Cell Classificaion App，分别用不同Label标记胞核、胞浆、胞膜，对于细胞核、细胞膜和细胞浆分别分析输出。

6、       结果输出整理

输出Excel格式分析文档。