核酸药物之体外转录mRNA疫苗
作为mRNA的头部企业，辉瑞/BioNTech、Moderna的新冠疫苗相继上市，打破了核酸难以成药的瓶颈。国内药企在这领域也是佳音频传，已经有多款新冠疫苗拿到了临床批件，相信用不了多久就有国产新冠mRNA疫苗上市的消息。我们知道，打造一款药物，稳定的供应链对于药企来讲是极其重要的，基于现在变化莫测的国际形势，实现mRNA产业链国产化显得尤为重要。
mRNA药物介绍
mRNA药物的基本原理是将经过修饰的mRNA注入体内，其能在细胞质内表达相应蛋白产物，从而发挥疗效。以新冠mRNA疫苗为例，将编码新冠病毒S蛋白的mRNA直接注射入体内，能够在体内合成S蛋白，模拟病毒感染，刺激机体产生抗体，从而达到预防新冠病毒感染的作用。理论上，mRNA能够表达任何蛋白质，可用于预防性疫苗、肿瘤疫苗、抗体和蛋白替代疗法等基于蛋白质的疗法。
mRNA的序列设计和LNP递送系统是mRNA疫苗生产过程中最重要的环节。序列设计可调节优化mRNA的表达效率，是核酸疫苗发挥作用的基础。有效的递送系统对mRNA疫苗发挥作用至关重要。下面将着重介绍mRNA的结构和LNP递送系统。
mRNA结构介绍
成熟mRNA的主体序列是编码区，在其上游5’端和下游3’都有非编码区，结构部分依次为5’端帽子、5’端UTR、CDS、3’端UTR和3’端poly（A）尾。
帽子结构对稳定mRNA及其翻译具有重要意义，它将5’端封闭起来，可免遭核酸外切酶水解。
5’非翻译区（5’ untranslated region, 5’UTR）是帽子与编码区起始密码子之间的一段较短的序列，其中包括标志翻译起始的序列。
编码区（Coding Sequence，也称ORF区）由起始密码子开始，到终止密码子截止，编码一种蛋白质的一级结构。其中每三个碱基构成一个密码子，编码一个氨基酸。编码区的二级结构和密码子选择都可能影响翻译效率。过多的二级结构和稀有密码子都会降低翻译速度，所以基因工程表达蛋白时会根据宿主的密码子偏好性进行优化。
3’非翻译区是终止密码子以后的转录序列，其中含有加尾信号。3’非翻译区也参与翻译调控，比如很多microRNA可以与靶基因mRNA的3’非翻译区结合，通过降解或抑制翻译过程下调靶基因的表达。
3’端尾部是一段多聚A序列。成熟的mRNA一般在它的3’端都加上了长度为20-200碱基的多聚A尾，可以防止外切酶降解，也可以作为核孔转运系统的标志，与成熟的mRNA通过核孔转运到胞浆有关。
熟悉了mRNA结构各部分的作用，对于序列的优化提供了理论基础，通过实验数据的积累以达到设计目的。
LNP递送系统介绍
如何特异性地将mRNA递送进入靶细胞需要解决三大难点：胞外屏障、内体逃逸与胞内免疫。mRNA疫苗只有经过这三重考验后才到达细胞内靶部位，最终发挥功能。LNP是目前应用在mRNA递送的主要技术手段。
脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle,LNP）是使用脂质形成纳米微粒，结构为有磷脂双层组成的囊泡。通过将核酸药物装载到LNP中，可保护被包裹的核酸药物免于降解和清除，并促进其跨细胞膜运输到目标靶位。其组成为：阳离子脂质、中性辅助脂质、胆固醇、聚乙二醇修饰的脂质。
在LNP的制备中，主要取决于自组装能力，即脂质成分发生分子间相互作用而自发组织成纳米结构实体。首先，带负电荷的核酸和带正电荷的脂质之间通过静电结合，然后，通过脂质组分之间的疏水作用和范德华作用进行组装，进而形成LNP。
LNP传统的制备方法是两相混合再经均质技术（高压均质机、高压微射流）或者挤出技术（聚碳酸酯膜过滤器）控制粒径。该法制备得纳米粒形成多层结构，mRNA分子夹在同心脂质双层。该方法包封率普遍不高，并且需要高精度高专业化的设备，导致工艺放大困难。
另外一种方法时乙醇稀释法。将各种脂质溶解在乙醇中，mRNA溶于酸性水缓冲液中，将两相快速混合。通过稀释乙醇相，脂质的溶解度降低，在混合溶液中逐渐析出凝固并形成脂质纳米粒，同时高效包载mRNA。
目前，商业化大规模生产mRNA/LNP利用微流控或T型接头混合技术，该制备方法快速简便，对于疫苗这类小剂量药物具有明显优势。
英赛斯的纳米质粒组装系统，提供具有核心专利技术的输液泵，不但在耐受一定压力的情况下可以精准且平稳的输送所需原料，而且可以满足GMP的法规要求，独特的微流控设计保证纳米粒子与mRNA的高效混合，且可精准的保证粒子的粒度及形态。目前已在多家专注于药物递送系统的生物公司的纳米药物制备中发挥关键作用。
Unique AutoMCD纳米质粒组装系统
mRNA疫苗整体生产工艺
DNA质粒生产
1. 菌株的构建：将含有目标核酸序列的质粒，转导至大肠杆菌中。这里的核酸序列可以是从病毒中提取，但更安全有效的方法是根据发表的核酸序列优化设计直接连接到质粒上，避免跟病毒直接接触；
2. 发酵：适宜条件下存放发酵，使其复制亿万级别的质粒；
3. 质粒纯化：发酵结束后，加入酶或者其他化学物质裂解大肠杆菌细胞壁，收集并纯化质粒；
4. 质粒DNA：通过1至3步骤，最终收获质粒DNA。
mRNA转录和纯化
5. 质粒DNA线性化：加入限制性核酸内切酶，从环状的质粒中切割出直线段的病毒基因，并除去残留的细菌和质粒片段；
6. 体外转录：根据“中心法则”，以DNA为模板转录成mRNA；
7. 加帽和纯化：通过加帽加尾完成mRNA的结构完整化，通过纯化，去掉不完整杂质片段；
8. mRNA原液：通过5至6步骤，最终收获mRNA原液。
mRNA-LNP制剂
9. LNP封装：准备好脂质原料，与mRNA原液通过精确的控制，将他们混合成脂质纳米粒。
10.TFF（切向流过滤）：将收获的脂质纳米粒通过切向流过滤的方式进行浓缩和换液；
11.除菌过滤：对已经浓缩的脂质纳米粒进行最后的除菌过滤;
12.mRNA-LNP：通过9至11步骤，最终收获mRNA-LNP
仪器介绍
苏州英赛斯作为研发生产、销售为一体的仪器厂商，其研发的核酸合成及纯化仪器媲美进口设备，完美实现国产化。上市后迅速获得国内大型CDMO以及小核酸药物企业的认可。我们不仅提供稳定高效的核酸合成仪、纯化仪、HPLC系列仪器设备，同时公司重金搭建应用服务平台，意在为客户提供全方位服务和整体解决方案
Unique AutoPure纯化系统
英赛斯Unique AutoPure纯化系统是公司独立研发生产的纯化系统，因其成熟的工艺，上市以来销量连年增涨，为生物制药企业的首选。同时今年3月，Unique AutoPure Pilot600隆重上市，这是一款适用于中试规模的台式层析系统，可提供符合GMP或非GMP两种不同工作环境的两种配置，系统工作流量、耐压范围、检测范围宽泛，可满足不同层析类型的小规模研发、工艺放大及小规模GMP生产。
Unique AutoPure纯化系统
Unique AutoPure Pilot600系统
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