体外透皮吸收对比试验常见问题分析

      皮肤外用制剂主要应用于皮肤表面，用于保护、治疗皮肤各部位疾病或治疗某些系统性疾病。按形态分类，皮肤外用制剂有半固体剂型、液体剂型及固体剂型，其中半固体剂型最为常见，主要包括软膏剂、乳膏剂及凝胶剂等。半固体剂型的处方通常较为复杂，多由水相 /油相两相组成，活性成份可能溶解或分散在其中一相或二相中 ［1］ 。其物理特性取决于多种因素，包括分散相粒径、各相之间的界面张力、各相之间的活性成份分配系数，以及制剂的流变学性质，上述因素共同决定了药物的释放性能 ［2］ 。

      目前在进行仿制药研究及变更研究中，均需要考察仿制药或变更后产品与原研制剂的一致性 ［3］ 。其中，基于开放扩散池系统的体外透皮吸收对比试验，已经广泛用于皮肤外用半固体制剂处方和工艺研究，用以考察皮肤外用半固体制剂的仿制品或处方工艺变更后产品与原研品在透皮吸收程度的差异。

      而从目前对皮肤外用半固体制剂仿制及变更申请的技术审评结果看，体外透皮吸收对比试验研究存在一些比较突出的问题。本文结合审评情况，阐述在皮肤外用半固体制剂的仿制及变更研究中，进行自制样品与原研产品体外透皮吸收对比试验的技术要求，并分析审评资料常见问题，供申请人进行相关研究参考。

1 体外透皮吸收对比试验的技术要求

      体外透皮吸收对比试验包括体外透皮吸收试验方法的建立、测定方法的建立及方法学验证、实际样品试验与检测及数据统计分析等部分。

1.1 外透皮吸收试验方法的建立  皮肤外用制剂体外透皮吸收试验一般基于开放扩散池系统，如Franz 扩散池系统，由供应池、离体皮肤( 人或小型猪) 或聚合物膜、接收池组成。其方法建立时需确定试验温度、接收介质种类及体积、搅拌速度、透皮面积、离体皮肤前处理方式、上药量、取样时间及次数等。

      接收介质种类的筛选与药物溶解度及药物在溶液中的稳定性有关，尽量与生理条件接近，如 PBS缓冲液( pH 7. 4) ，同时需满足漏槽试验要求。一般水溶性好的药物选择水溶性溶液，而水溶性较差的药物可考虑适当加入乙醇等有机溶剂或表面活性剂，但可能改变皮肤特征或溶解其中类脂成分，添加时应慎重。体表温度为 32 ℃ ，人体温度为 37 ℃ ，水浴温度应优先模拟生理条件的温度。透皮面积与接收介质体积及装置有关，取样次数一般不少于 5次，确定试验时间时建议考虑药物的使用频率。皮肤外用半固体制剂多作用于皮肤表面及皮肤中，为了与原研产品进行皮肤渗透性比较，常采用离体皮肤(人或小型猪或实验鼠) 试验。

1.2 测定方法的建立及方法学验证  在用离体皮肤进行体外透皮吸收试验时，通常需分别测定表皮残留量、皮内滞留量及透皮量。 表皮残留量是指完成透皮试验后表皮上残留药物量，常采用药物含量测定方法。皮内滞留量是指完成透皮试验后皮肤内滞留的药物量，方法建立时需考虑其样品中包含皮肤，需考虑生物样品定量分析方法的特点。透皮量是指在透皮试验不同取样点累积透过皮肤的药物量，除药物外皮肤成分也可能进入接收介质，使得透皮液成分可能较为复杂，方法建立时需关注皮肤对检测的影响。药物作用的部位不同，在各部位分布的药物量不同，检测对象组成不同，检测方法的灵敏度要求也不同，常需分别建立检测方法，并结合检测样品特点进行全面方法学验证。

      表皮残留量如采用药物含量测定方法，其方法学验证同含量测定项下; 如新建方法，需重新进行方法学验证。对于作用于皮肤表面及皮肤内的皮肤外用半固体制剂，相对表皮残留量，其皮内滞留量及透皮量较小，甚至低于检出限，因此需关注方法灵敏度是否能满足检测需要。另外，在进行皮内滞留量及透皮量方法学验证时，还需参考生物样品定量分析方法验证的要求，如采用 LC-MS/MS 测定，应考察专属性、线性范围、灵敏度、基质效应、方法回收率、提取回收率、样品溶液稳定性、日间与日内精密度等。 

1.3 实际样品测定  通常需进行多次重复试验，建议至少进行 6 个样品试验，需注意装置使用方式，尽可能消除系统差异。如所用仪器可以同时试验 6 个样品，建议原研产品与自制样品分 2 次完成试验，每次各 3 个样品，所用接收池均有一次用于 2 种样品试验; 如所用仪器不能同时试验 6 个样品，建议遵循在同一次运行中包括原研产品与自制样品的原则;而如所用仪器每次仅可进行 1 个样品试验，应交替测定原研产品与自制样品，而不是在获取一种制剂的所有检测数据后，再获取另一种制剂的全部检测数据。

      在采用拟定方法进行表皮残留量、皮内滞留量及透皮量测定时，对于检测浓度较低的皮内滞留量及透皮量，同样需参考生物样品分析测定要求，如每次测定时建立随行标准曲线及质控样品。另外，试验用自制样品至少为中试样品，其批量及所用生产设备应与拟定大生产批量的匹配。

1.4 数据统计分析  基于测得的表皮残留量、皮内滞留量及不同取样点累积透皮量，结合上药量，可分别计算出原研产品与自制样品的透过百分率( % ，累积透皮量/上药量) 、吸收百分率( % ，皮内 滞留量/上药量) 及总体回收率( % ，表皮残留 量/上药量) ，根据上述三部分试验结果计算回收率，考察是否达到物料平衡; 再采用适宜软件对原研产品与自制产品的皮内滞留量、透皮量进行数据统计分析，确定二者有无明显差异。

      另外，理论上半固体系统中，单位面积药物的释放量与时间的平方根成正比。也可结合透皮面积，可以计算各时间段单位面积药物透过量，并与相对时间平方根绘制标准曲线，直线的斜率( 回归) 代表制剂的透过率，采用适宜软件对原研产品与自制产品的透过率进行数据统计分析，评估原研产品与自制产品间透过率有无明显差异。

2 常见问题分析

2.1 处方工艺研究未进行外透皮吸收试验  皮肤由表皮、真皮和皮下组织三部分组成。临床上皮肤用药部位不同时皮肤渗透要求不同，如对于在表皮上局部作用的抗菌剂，需要药物释放到皮肤表面; 对于治疗皮炎、湿疹，因其过度角质化而要对角质层作用; 对于治疗脂溢性皮炎，因需作用于皮肤附属器，而需要作用于活性表皮与真皮; 对于各种肌肉拉伤、扭伤等的对症治疗及由类风湿关节炎引起的疼痛的辅助治疗，需药物透皮进入皮肤下组织而发挥作用。

      局部表面起作用的药物，如滞留在皮内的药物量、透过皮肤进入体内的药物量大于原研产品，不能支持评价其安全性。皮内滞留起作用的药物，其滞留在皮内的药物量应与原研产品无明显差异，才可能达到药效一致; 而透过皮肤进入体内的药物量应不大于原研产品，以支持评价其安全性。局部用药全身作用的品种，其透过皮肤进入体内的药物量与原研产品应相当，才能支持评价给药一致性。而药物的皮肤渗透过程涉及多个步骤，影响药物渗透因素也较多［4] ,在进行仿制药研究及涉及其处方工艺的变更研究中，为了保证皮肤外用半固体制剂与原研产品的给药一致性，其处方工艺研究有必要进行体外透皮吸收对比试验，以考察皮肤外用半固体制剂的仿制品与原研品在透皮吸收程度的差异。

2.2 考察项目缺失  审评中发现,有些申请人虽然进行了体外透皮吸收对比试验，但仅考察了透过量，而未测定表皮残留量与皮内滞留量，未能对比皮内滞留量有无明显差异，是否达到物料平衡; 也未结合药物作用部位，分析考察项目设置的合理性，不能全面对比皮肤外用半固体制剂仿制品或处方工艺变更后产品与原研品在透皮吸收程度的差异 ［5］ 。

2.3 方法学验证不全面  方法学验证有时有缺失项目的现象，如未考察关键项目定量限、检出限，特别是检出结果为未检出时，不能评估检出量，不能评价方法灵敏度是否满足要求及方法是否具有可行性。

2.4 提供的体外透皮吸收试验方法研究资料不全面  申报资料有时仅提供了体外透皮吸收试验，但未提供接收介质种类筛选过程，未分析接收介质选择的合理性，或未说明各参数确定依据，不能全面科学评价外透皮吸收试验方法的合理性与适用性。

2.5 样品测定中常见问题  审评资料中常见问题为未说明或未考虑样品试验顺序，不能评估试验是否能有效避免系统误差; 有时会忽视生物样品分析的特殊性，未说明或未提供随行标准曲 线及质控

样品相关信息，不支持评价测定结果的准确性和可靠性; 还有存在未提供所采用的离体皮肤( 人或小型猪) 或聚合物膜的来源及供给证明性文件的现象。

2.6 数据统计分析  体外透皮吸收试验的目的是考察自制品与原研产品透皮吸收过程的异同，因此后续数据处理及统计较为关键。申报资料中有时申请人未明确统计所用软件，或未采用软件进行统计分析,不支持评价结果的合理性。

3 结语

      体外透皮吸收研究已经广泛用于皮肤外用半固体制剂处方和工艺研究，在进行仿制及变更研究中，进行自制样品与原研产品进行体外吸收对比试验是保证仿制药或变更后产品与原研产品给药一致性的简便有效手段。实际研究过程中除参考国内外相关的指导原则及文献外，还需结合产品特点，进行科学全面的研究，以保证测定结果准确可靠。

【参考文献】

［1］ 国家食品药品监督管理局.已上市化学药品变更研究的技术指导原则［S].2008．

［2］ FDA. Guideline for Industry Nonsterile Semisolid Dosage Forms;Scale-Up and Post-Approval Changes: Chemistry，Manufacturingand Controls; In Vitro Ｒelease Testing and In Vivo BioequivalenceDocumentation［ EB /OL].( 1997 ) .http: / /119.90.25.34/www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm070930.pdf．

［3］ 国家食品药品监督管理局.已有国家标准化学药品研究技术指导原则［S].2007.

［4］ 平其能，屠锡德，张钧寿，等，药剂学［M].第 4 版.北京: 人民卫生出版社，2013: 801 － 803．

［5］ 李金红，贺亚静，贺吉香，等． 复方利多卡因乳膏体外经皮渗透比较研究［J].中国新药杂志，2015，24( 13) : 1541 － 1545．